發(fā)布時間：2018-01-25 02:24

  本文關鍵詞： 乙型肝炎病毒(HBV) α干擾素(IFN-α) 泛素特異性蛋白酶18(USP18) 干擾素刺激基因(ISGs) RNA干擾　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個世界性的問題。盡管有效的乙肝疫苗已在臨床上廣泛運用。慢性HBV感染能夠導致肝硬化和肝細胞肝癌等危害嚴重的終末期肝病。雖然近年來有多種抗HBV藥物不斷涌現(xiàn),但α干擾素(IFN-α)是目前治療慢性HBV感染的首選藥物之一,其具有療程固定、停藥后復發(fā)率低、部分患者可出現(xiàn)HBs Ag陰轉而獲得“徹底治愈”等優(yōu)點。長效聚乙二醇干擾素還具有用藥間隔時間長、副作用相對較少等優(yōu)點。但目前仍面臨著價格昂貴和相當一部分患者的持續(xù)病毒學應答率低等問題。IFN-α應答率低的具體分子機制仍不十分明確,有待進一步研究。在前期的工作當中我們發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者IFN-α治療前應答組和無應答組肝細胞中存在大量差異表達的基因。其中干擾素刺激基因USP18和ISG15位于同一信號通路,USP18在治療前在無應答組中高表達,提示其可能與IFN-α抗HBV的活性相關,HBV可能調控宿主細胞中USP18的表達,進而改變IFN-α的抗病毒活性。目的:1.HBV感染肝癌細胞對USP18表達的影響。2.構建sh RNA-USP18慢病毒載體,研究其對Hepg2.2.15細胞內HBV復制能力的影響。3.研究sh RNA-USP18慢病毒載體在不同濃度IFN-α作用下對HBV復制能力的影響。4.研究sh RNA-USP18慢病毒載體是否是通過調控JAK/STAT信號通路調節(jié)IFN-α的抗HBV作用。5.利用生物信息學初步分析Hepg2.2.15-sh RNA-USP18細胞中的差異表達基因及相關信號通路。方法:1.利用實時熒光定量PCR分析不同肝癌細胞系中USP18 m RNA的表達水平。轉染HBV表達質粒,利用實時熒光定量PCR、Western blot及雙熒光素酶實驗檢測HBV感染對USP18 m RNA、蛋白及啟動子活性的影響。2.構建sh RNA-USP18慢病毒載體,利用實時熒光定量PCR篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體,并篩選出穩(wěn)定細胞株。利用實時熒光定量PCR、Western blot驗證Hepg2.2.15-sh RNA-USP18細胞中對USP18的干擾效率。3.利用定量PCR檢測干擾USP18表達對Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA復制的影響。利用ELISA檢測干擾USP18對Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影響。利用熒光定量PCR檢測過表達USP18對Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA復制的影響。利用ELISA檢測過表達USP18對Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影響。4.利用熒光定量PCR檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBV復制的影響。利用ELISA檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBc Ag生成的影響。5.利用熒光定量PCR檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1 m RNA的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1蛋白的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α處理不同時間點及不同加藥方式對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達的影響。6.利用基因芯片檢測干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中差異表達的基因,并利用公共數(shù)據(jù)庫及相關軟件對差異表達的基因進行生物信息學分析。結果:1.Hepg2.2.15細胞中USP18的表達水平較其他肝癌細胞中的表達高,HBV明顯促進宿主細胞中USP18的表達,選擇Hep G2和Hepg2.2.15細胞用于后續(xù)實驗。HBV感染能夠促進Hep G2細胞中USP18 m RNA和蛋白的表達,并能增強其啟動子活性。2.針對USP18篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體并構建穩(wěn)定細胞株Hepg2.2.15-sh RNA-USP18。Hepg2.2.15-sh RNA-USP18細胞中USP18m RNA和蛋白的表達受到明顯抑制。3.干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA的復制受到明顯抑制。Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag的分泌受到明顯抑制。過表達USP18后Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA的復制明顯增強。Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag的分泌明顯增強。4.干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA復制的抑制作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的抑制作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBc Ag生成的抑制作用明顯增強,且在IFN-α不同濃度組中均有明顯的抑制作用。5.干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1 m RNA和蛋白的誘導作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1表達的誘導作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α處理不同時間點,Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1表達明顯增強。不同加藥方式下干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1表達明顯增強。6.初步篩選出干擾USP18后Hepg2.2.15細胞中差異表達的基因及相關的生物學功能和信號通路。結論:1.肝癌細胞Hep G2中HBV感染可促進USP18的表達并增強USP18啟動子的活性。2.干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中HBV的復制和分泌受到明顯抑制。3.干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBV的抑制作用增強。4.USP18能夠通過調節(jié)JAK/STAT信號通路的活性來調節(jié)IFN-α的抗病毒活性。
[Abstract]:Hepatitis B virus (hepatitis B, virus, HBV) infection is a worldwide problem. Although effective hepatitis B vaccine has been widely used in clinical. Chronic HBV infection can lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma and other serious end-stage liver disease. In recent years there are many kinds of anti HBV drugs are emerging, but alpha interferon (IFN- alpha) is currently the primary drug for the treatment of chronic HBV infection and its treatment with fixed, low recurrence rate after drug withdrawal, some patients may appear HBs Ag to obtain advantages of "thoroughly cure Yin". Long-acting pegylated interferon medication has a long time interval, relatively few side effects and other advantages. But it is still facing the price is expensive and a considerable part of the molecular mechanism of sustained virologic response in patients with low rate of.IFN- a low response rate is still not very clear, needs further research. In previous work, when I They found that before the treatment response group and non response group of liver cells in the presence of a large number of differentially expressed genes of hepatitis B patients. The slow IFN- alpha interferon stimulated gene USP18 and ISG15 in the same signaling pathway, the expression of USP18 in non response group before treatment, suggesting that IFN- and alpha anti HBV activity, HBV the regulation of USP18 expression in the host cell, and then change the antiviral activity of IFN- alpha. Objective: 1.HBV infected liver cells on the expression of USP18.2. sh RNA-USP18 influence construct lentiviral vector, to study its effect on Hepg2.2.15 cells in HBV replication competent.3. RNA-USP18 lentiviral vector of SH in different concentrations of IFN- under the influence of alpha HBV replication the ability of the.4. research sh RNA-USP18 lentiviral vector is regulated by JAK/STAT signal pathway of IFN- alpha of the anti HBV effect of.5. by bioinformatics analysis of the Hepg2.2.15-sh RNA-USP18 Differential expression of genes and signaling pathways in cells. Methods: 1. using real-time fluorescence quantitative PCR analysis of the expression levels in different hepatoma cell lines USP18 m RNA. Transfection of HBV expression plasmid, using real-time fluorescence quantitative PCR, the USP18 m RNA Western blot infection and dual luciferase reporter assay HBV,.2. protein and promoter activity the construction of SH RNA-USP18 lentiviral vector, using real-time fluorescence quantitative PCR screened lentiviralvector efficiency, and selected stable cell lines. Using real-time fluorescence quantitative PCR,.3. interference efficiency of USP18 detected by USP18 quantitative PCR interference on the expression of Hepg2.2.15 cells in HBV DNA Western blot Hepg2.2.15-sh verification of RNA-USP18 cells, influence PG RNA and total RNA replication. The influence of using ELISA for detection of USP18 interference on the secretion of Hepg2.2.15 cells in HBs Ag and HBe Ag. Measured by fluorescent quantitative PCR. The expression of USP18 on Hepg2.2.15 cells in HBV DNA, PG RNA and total RNA replication effect. The detection of overexpression of USP18 on Hepg2.2.15 cells in HBs Ag and HBe Ag secretion of.4. by fluorescence quantitative PCR detection in USP18 knockdown IFN- alpha on the replication of HBV in Hepg2.2.15 cells affected by ELISA. By using ELISA interference detection USP18 IFN- HBs Ag alpha on Hepg2.2.15 cells and HBe Ag expression. After using Western blot to detect USP18 knockdown of IFN- alpha effect on Hepg2.2.15 cells in HBc Ag generated.5. using fluorescence quantitative PCR to detect the expression of USP18 after interferon alpha IFN- interference on the downstream of JAK/STAT in Hepg2.2.15 cells stimulated genes ISG15, A and IFIT1 Mx m RNA. Using Western blot detection USP18 gene ISG15 interference IFN- interferon alpha on the stimulation of downstream JAK/STAT expression in Hepg2.2.15 cells after A, effects of Mx and IFIT1 protein by Weste. RN blot detection in USP18 knockdown of IFN- alpha on the expression of phosphorylated JAK/STAT signal pathway of STAT1 and STAT1 protein in Hepg2.2.15 cells. Using Western blot to detect USP18 expression after IFN- interference treatment at different time points and different methods of adding to the differential expression of.6. gene expression by gene chip detection of USP18 interference in Hepg2.2.15 cells after effect the expression of phosphorylated JAK/STAT signal pathway of STAT1 and STAT1 protein in Hepg2.2.15 cells, bioinformatics analysis of differentially expressed using public databases and software related genes. Results: the expression level of USP18 in 1.Hepg2.2.15 cells compared with other cancer cells in high, HBV significantly promotes the expression of USP18 in the host cell, select Hep G2 and Hepg2.2.15 cells for subsequent experimental infection of.HBV can promote the expression of USP18 m and RNA Hep protein in G2 cells, and can increase The strong promoter activity of.2. in USP18 were screened out the best jamming efficiency of lentiviral vector and expression of RNA protein and construct a stable cell line USP18m Hepg2.2.15-sh RNA-USP18.Hepg2.2.15-sh in RNA-USP18 cells was significantly inhibited the expression of.3. USP18 interference in Hepg2.2.15 cells after HBV DNA, PG RNA and total RNA replication was significantly inhibited.Hepg2.2.15 cell secretion in HBs and Ag HBe Ag was significantly inhibited. Overexpression of USP18 in Hepg2.2.15 cells after HBV DNA, PG RNA and total RNA replication significantly enhanced secretion of.Hepg2.2.15 cells in HBs Ag and HBe Ag significantly increased the expression of.4. after USP18 interference of Hepg2.2.15 cells in HBV IFN- alpha DNA, PG RNA and total inhibited RNA replication significantly enhanced. Inhibitory effect of USP18 expression after IFN- interference of Hepg2.2.15 cells in HBs Ag alpha and HBe Ag secretion increased significantly. After the expression of USP18 interference on IFN- alpha Hepg2.2.1 Inhibition of HBc Ag generated 5 cells increased significantly, and IFN- in different concentrations of alpha group significantly inhibited.5. USP18 expression after IFN- interference of interferon alpha on the downstream of JAK/STAT in Hepg2.2.15 cells stimulated ISG15 gene induced by Mx A IFIT1 and m RNA and protein significantly enhanced. USP18 knockdown of IFN- alpha induction effect on the expression of phosphorylated JAK/STAT signal pathway in STAT1 Hepg2.2.15 cells increased obviously. After the expression of USP18 interference to IFN- treatment at different time points, phosphate JAK/STAT pathway in the expression of STAT1 was significantly enhanced in Hepg2.2.15 cells. The expression of USP18 signaling pathway in the phosphorylation of JAK/STAT increased the expression of STAT1.6. was screened differentially expressed in Hepg2.2.15 cell interference after the USP18 gene and the related biological function and signaling pathways significantly in Hepg2.2.15 cells after interference with dosing mode. Conclusion: 1. small hepatocellular carcinoma Can promote the expression of USP18 and enhance the activity of.2. USP18 interference USP18 promoter expression in Hepg2.2.15 cells after HBV replication and secretion by.4.USP18 through regulating the activity of the JAK/STAT signaling pathway to regulate the antiviral activity of IFN- alpha IFN- alpha inhibition on Hepg2.2.15 cells in HBV inhibited the expression of.3. USP18 after HBV infected cell interference Hep G2.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62

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