本文關(guān)鍵詞： 心肌細(xì)胞缺氧 自噬 震波治療 AMPK/mTOR　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:盡管近年來針對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)的藥物治療、介入治療(PCI)和外科手術(shù)治療(CABG)取得了很大進(jìn)展,仍有部分嚴(yán)重冠心病患者不能耐受PCI或CABG治療,或已經(jīng)接受以上治療后仍有心絞痛癥狀反復(fù)發(fā)作。這類患者僅依賴單純的藥物治療,預(yù)后差,死亡率高。體外心臟震波治療是近年來針對嚴(yán)重冠心病患者的新的治療手段,目的是改善心肌供血和心臟功能。震波發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不甚明確,可能包括促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢、刺激血管新生和抑制氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等。我們前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)震波治療可減輕缺血缺氧所致的心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心臟功能。自噬是真核細(xì)胞特有的、能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的損傷蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解并重新利用的過程,可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新,在多種應(yīng)激和疾病中發(fā)揮重要作用。近年來,越來越多的研究證實(shí)自噬參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,但其究竟發(fā)揮正面或是負(fù)面作用,仍存在爭議。但有研究發(fā)現(xiàn)輕中度的缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬可能是保護(hù)性的,而震波治療能否通過影響自噬發(fā)揮心臟保護(hù)作用,目前尚無相關(guān)研究數(shù)據(jù)。研究目的:我們利用大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(1)通過選擇合適的缺氧培養(yǎng)條件,建立心肌細(xì)胞體外缺血缺氧模型,探討缺氧時自噬發(fā)生的情況及其作用;(2)選擇作用于缺氧心肌細(xì)胞的震波治療所需合適能量;(3)探討震波治療在缺氧損傷中對心肌細(xì)胞自噬的影響和其發(fā)揮作用可能的信號通路。研究方法:(1)H9c2細(xì)胞在填充有92%N2、5%C02和3%02的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時間后,測定細(xì)胞活性和細(xì)胞內(nèi)ATP水平以評價細(xì)胞損傷的程度;Western blot法檢測LC3B的表達(dá)水平,用LC3B-I/II評價自噬發(fā)生的強(qiáng)度。選擇中等強(qiáng)度細(xì)胞損傷且自噬發(fā)生較強(qiáng)的缺氧培養(yǎng)時間。(2)缺氧后,分別予細(xì)胞相對較低(0.02mJ/mm2)、中(0.05mJ/mm2)和高(0.10mJ/mm2)三種強(qiáng)度的震波治療,測定細(xì)胞活力和LC3B表達(dá)情況,選擇對細(xì)胞活力和自噬強(qiáng)度影響最顯著的震波能量。(3)用MDC法對自噬小泡進(jìn)行染色,進(jìn)一步驗(yàn)證震波治療對缺氧心肌細(xì)胞自噬水平的影響;測定震波治療前后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化,探討震波治療對細(xì)胞內(nèi)能量代謝的影響。(4)Western blot的方法測定震波治療對自噬相關(guān)主要信號通路蛋白(AMPK、mTOR和Beclin-1等)和細(xì)胞存活相關(guān)蛋白(Sirt1和HIF-1α)的表達(dá)情況的影響。研究結(jié)果:(1)缺氧處理后,H9c2細(xì)胞活力和ATP水平隨著缺氧時間延長逐漸降低,自缺氧6小時開始,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值開始增強(qiáng),24小時達(dá)高峰,此后隨著缺氧時間的延長,該比值逐漸呈下降趨勢。(2)震波治療尤其是相對中等強(qiáng)度的震波(0.05 mJ/mm2)能夠顯著改善缺氧組的細(xì)胞活力,且使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高,即缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平被進(jìn)一步增強(qiáng);而對照組的細(xì)胞活力在三種強(qiáng)度的震波治療前后均未見明顯變化,較低(0.02 mJ/mm2)或較強(qiáng)(0.10 mJ/mm2)能量的震波均未對自噬水平產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)意義的影響。(3)缺氧24小時后細(xì)胞內(nèi)自噬小泡的熒光強(qiáng)度明顯較對照組增強(qiáng),給予震波治療(0.05mJ/mm2)后熒光進(jìn)一步增強(qiáng)。檢測震波治療前后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)震波治療后,缺氧所致的ATP水平下降可較前明顯回升。(4)缺氧后,H9c2細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK、Beclin-1和HIF-1α表達(dá)上調(diào),而磷酸化mTOR和Sirt1下調(diào)。震波治療可進(jìn)一步增強(qiáng)磷酸化AMPK的上調(diào)和磷酸化mTOR的下調(diào),增強(qiáng)Sirt1的表達(dá)增加,降低HIF-1α的表達(dá)。研究結(jié)論:(1)缺氧培養(yǎng)24小時能夠造成H9c2細(xì)胞損傷、功能障礙和死亡;(2)缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬上調(diào),表現(xiàn)為LC3B-II/LC3B-Ⅰ比值增加和細(xì)胞內(nèi)自噬小泡數(shù)量明顯增加;(3)能量為0.05mJ/mm2的震波治療能夠進(jìn)一步提高缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬水平,減輕心肌細(xì)胞損傷,改善能量代謝,保護(hù)心肌細(xì)胞功能;(4)震波治療可能通過影響AMPK/mTOR信號通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬,可能通過Sirt1和HIF-1α通路促進(jìn)細(xì)胞存活,發(fā)揮心臟保護(hù)作用。
[Abstract]:In recent years , we have studied the effects of shock wave therapy on myocardial cell apoptosis and protecting heart function . ( 4 ) The effects of shock wave therapy on the expression of autophagy - related protein ( AMPK , mtor and Beclin - 1 , etc . ) and cell survival - related proteins ( Sirt1 and HIF - 1偽 ) were measured by Western blot . Results : ( 1 ) After hypoxia treatment , the activity and ATP levels increased gradually with the increase of hypoxia time . ( 4 ) After hypoxia , the expression of phosphorylated AMPK , Beclin - 1 and HIF - 1偽 was regulated .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1460959