本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞癌 磺酸基轉(zhuǎn)移酶 Isotope Label-free UHPLC-MS/MS 蛋白定量 個(gè)體化治療　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景和目標(biāo)肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床上最常見(jiàn)的高致死率,高發(fā)性惡性腫瘤。研究由HBV誘發(fā)的肝細(xì)胞癌中肝藥酶的基因和功能性的改變,從中掌握其變化規(guī)律,可為肝癌治療的合理用藥以及肝癌的早期診斷提供幫助。磺酸基轉(zhuǎn)移酶(Sulfotransferases:SULT),作為肝臟中主要的二相藥物代謝酶,涉及了易誘發(fā)癌癥物質(zhì)的激活和滅活過(guò)程。HCC狀態(tài)下SULTs酶活性和表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致難以預(yù)測(cè)藥物對(duì)腫瘤的療效及其對(duì)周?chē)M織的毒副作用。本研究擬檢測(cè)HCC腫瘤組織中SULTs酶活性、蛋白含量及mRNA表達(dá)水平的改變及其相關(guān)性,以白藜蘆醇為例探討HCC患者中SULTs酶活性改變對(duì)藥物代謝的影響,為臨床合理用藥提供參考。二、研究方法1:非同位素標(biāo)記液相與質(zhì)譜聯(lián)用方法(Isotope Label-free UHPLC-MS/MS)和蛋白免疫印跡方法(Western-blot)定量正常人肝組織S9(肝勻漿液的去線粒體上清液,包含了大量藥物代謝酶)中5種SULTs酶的蛋白表達(dá)。2:①差速離心法制備癌旁及HCC腫瘤組織S9蛋白。LC-MS/MS方法絕對(duì)定量5種SULTs酶在癌旁及HCC腫瘤組織S9中的蛋白含量。②底物探針?lè)椒ㄔu(píng)價(jià)SULTs酶活性。③采用Real-Time PCR方法研究SULTs酶mRNA表達(dá)水平。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.相比較Western-blot,LC-MS/MS分析方法有更好的專(zhuān)屬性和敏捷性為了驗(yàn)證分析方法的專(zhuān)屬性,分別運(yùn)用LC-MS/MS和Western-blot方法同時(shí)分析人源重組化SULTs蛋白。結(jié)果顯示,Westem-blot中只有40%抗體具有專(zhuān)屬性且整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)達(dá)24小時(shí)以上,而LC-MS/MS方法專(zhuān)屬性達(dá)到100%,耗時(shí)僅6個(gè)小時(shí)且完成一次樣品分析時(shí)間不超過(guò)10分鐘。2.在正常人肝組織S9中,SULTs酶蛋白定量和相關(guān)性分析分別運(yùn)用LC-MS/MS和Western-blot方法定量正常人肝組織S9中的5種SULTs酶蛋白表達(dá)。相關(guān)性分析顯示,除了 SULT1A3(r2=0.492)和SULT2A1(r2= 0.546),其他 SULTs 酶(SULT1A1、SULT1B1 和 SULT1E1)相關(guān)性都良好(r20.6,分別為 0.899、0.764 和 0.691,P0.05)。3.HCC腫瘤組織中SULTs酶蛋白含量變化用建立的LC-MS/MS方法首次絕對(duì)定量上述5種SULTs酶在正常人肝組織、癌旁和HCC腫瘤組織中的蛋白含量。結(jié)果顯示,SULT1A1在70%腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低,SULT1B1在20%腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低,SULT1A3在50%腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低,SULT1E1在40%腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低,SULT2A1在70%腫瘤組織中的蛋白含量顯著降低。并且,SULTs酶的蛋白含量具有很強(qiáng)的個(gè)體差異性。4.HCC腫瘤組織中SULTs酶活性及其對(duì)白藜蘆醇代謝處置變化運(yùn)用底物探針?lè)椒ㄏ到y(tǒng)地評(píng)價(jià)SULTs酶在混合的正常人肝組織S9、癌旁和HCC腫瘤組織S9中的代謝活性。結(jié)果顯示,HCC腫瘤組織S9中上述5種SULTs酶大部分對(duì)探針底物的代謝速率均顯著降低(SULT1A3和SULT1B1除外)。另外,SULTs酶在腫瘤組織S9中的催化能力(TONs)均與正常和癌旁組織S9無(wú)顯著性差異(SULT1A1除外)。個(gè)體研究顯示,SULT1A1在100%腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低,SULT1B1在20%腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低,SULT1A3在30%腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低,SULT1E1在50%腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低,SULT2A1在80%腫瘤組織S9中的酶活性顯著降低。另外,在HCC腫瘤組織S9中白藜蘆醇的滅活速率會(huì)顯著性降低。個(gè)體研究顯示,在個(gè)別HCC腫瘤組織S9中白藜蘆醇磺酸化代謝產(chǎn)物的生成速率遠(yuǎn)大于正常和癌旁組織S9。5.HCC腫瘤組織中SULTs酶mRNA表達(dá)水平變化相比較于癌旁組織,SULTs酶mRNA表達(dá)水平在90%以上腫瘤組織樣品中顯著下調(diào)90%以上(SULT1B1除外),并且個(gè)體差異的現(xiàn)象尤為突出。6.SULTs酶蛋白含量與代謝活性的變化及其對(duì)白藜蘆醇代謝處置的相關(guān)性結(jié)果顯示,癌旁和HCC腫瘤組織S9中SULTs酶活性與其蛋白含量具有較強(qiáng)相關(guān)性(r20.6,SULT1A3除外),而與mRNA表達(dá)水平相關(guān)性較弱。白藜蘆醇在體內(nèi)的代謝由SULTs酶的參與。相比較于癌旁組織,白藜蘆醇在HCC腫瘤組織S9中的代謝速率與SULT1A1的酶活性及蛋白含量相關(guān)性更加顯著(r20.6)。四、結(jié)論SULTs酶蛋白含量下調(diào)會(huì)引起HCC腫瘤組織S9中SULTs酶活性顯著降低,而酶蛋白分子催化能力并未顯著改變。同時(shí),本研究建立了一種快速、靈敏和準(zhǔn)確的LC-MS/MS方法可同時(shí)測(cè)定正常人肝組織S9,癌旁和HCC腫瘤組織S9中SULTs酶蛋白絕對(duì)含量;并以白藜蘆醇為例探討HCC患者中SULTs酶活性改變對(duì)藥物代謝處置的影響,可為臨床合理用藥提供方法學(xué)的參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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