本文關(guān)鍵詞： 雌激素受體1 慢加急性乙型肝炎肝衰竭 甲基化 預(yù)后 外周血單個(gè)核細(xì)胞 HBV相關(guān)肝癌 甲基化 雌激素受體1 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b CDH1　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分:ESR1基因啟動(dòng)子甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情評(píng)估中的研究研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)是指在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的基礎(chǔ)上,短期內(nèi)出現(xiàn)急性或亞急性的肝功能損害,主要表現(xiàn)為極度乏力、高膽紅素血癥、凝血功能障礙、失代償性腹水和肝性腦病,嚴(yán)重危及患者的生命健康。ACHBLF進(jìn)行性發(fā)展,出現(xiàn)多器官功能衰竭,短期內(nèi)死亡率極高。早期診斷ACHBLF,在適宜的時(shí)間點(diǎn)采取恰當(dāng)?shù)母深A(yù)手段有可能降低ACHBLF的發(fā)病率和死亡率。雖然終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease.MELD)已成為現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng)用的精確評(píng)估肝病嚴(yán)重程度的評(píng)分系統(tǒng),但此標(biāo)準(zhǔn)建立在肝硬化基礎(chǔ)之上,不是特異性的針對(duì)HBV感染所致的肝衰竭,而且用于ACHBLF患者的預(yù)后判斷時(shí)準(zhǔn)確性下降,因此急需尋找一種可以在ACHBLF發(fā)展的早早期階段就可以精確判斷其預(yù)后的標(biāo)記物。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),ACHBLF的發(fā)病率在男性患者遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性,這種性別差異可能是由于雌激素表達(dá)減少或是對(duì)雌激素的反應(yīng)性降低所致。在肝臟,雌激素只有與雌激素受體(Estrogen Receptor,SR),尤其是ESR1結(jié)合后才能發(fā)揮延緩肝細(xì)胞凋亡、改善肝纖維化、抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。HBV可以促進(jìn)宿主ESR1基因的高甲基化,ESR1達(dá)降低,誘導(dǎo)肝病的發(fā)生,但ESR1基因啟動(dòng)子的異常甲基化在ACHBLF患者中所起的作用還未有研究。研究目的通過檢測(cè)對(duì)比健康人(Healthy controls,HC)、CHB、肝衰竭前期及ACHBLF早期、中期、晚期三期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),分析ESR1啟動(dòng)子的甲基化從HC、CHB、肝衰竭前期至肝衰竭時(shí)的動(dòng)態(tài)變化并與ACHBLF患者的病情相結(jié)合,初步探討PBMC-ESR1啟動(dòng)子的甲基化作為無創(chuàng)性的指標(biāo)早期預(yù)測(cè)ACHBLF患者短期28天生存狀態(tài)的可行性。研究方法研究對(duì)象為2009年9月到2016年1月間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科接受治療的131例ACHBLF患者,隨機(jī)選取同一時(shí)間段的73例CHB患者和40例HC作為對(duì)照組。131例ACHBLF患者中,113人在入院時(shí)已被診斷為ACHBLF(包括早期患者67例,中期29例,晚期17例),另外18人在住院期間從肝衰竭前期逐步進(jìn)展至ACHBLF,作為動(dòng)態(tài)觀察組。所有的ACHBLF患者追蹤隨訪28天。甲基化特異性PCR方法檢測(cè)HC組、CHB、肝衰竭前期和ACHBLF患者PBMC-ES1基因啟動(dòng)子甲基化率,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1 mRNA的表達(dá)�？ǚ綑z驗(yàn)分析不同組ESR1甲基化率的比較,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響ACHBLF患者生存的危險(xiǎn)因素,Kaplan-Meier方法計(jì)算生存曲線,ROC曲線判斷PBMC-ESR1啟動(dòng)子的甲基化早期判斷ACHBLF患者預(yù)后的合理性。研究結(jié)果1.ACHBLF組和CHB組在進(jìn)行HBeAg、HBeAb、HBV-DNA比較時(shí)無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ACHBLF組、CHB組、HC組三組間比較時(shí),年齡、性別、肌酐均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而顯示肝衰竭嚴(yán)重程度的總膽紅素、白蛋白、凝血酶原活動(dòng)度、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);ACHBLF組中腹水、肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的發(fā)生率分別為66.37%、30.97%和27.43%,死亡率為67.26%。ACHBLF患者生存組的總膽紅素(P=0.003)、肝性腦病的發(fā)生率(P=0.001)、MELD值(P0.001)明顯低于非生存組,其他臨床指標(biāo)均沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.ACHBLF患者PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率(66.37%)明顯高于CHB組(21.92%,P0.001)和HC組(11.54%,P0.001),但CHB組和HC組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ACHBLF非生存組PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率顯著高于生存組(77.63%vs 29.73%,P0.001);ACHBLF患者甲基化組ESR1 mRNA的表達(dá)量明顯低于非甲基化組(P0.001)。3.ACHBLF患者PBMC-ESR1啟動(dòng)子甲基化組的白蛋白水平顯著低于非甲基化組(P= 0.027),MELD值則高于非甲基化組(P= 0.044),其他臨床指標(biāo)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.從肝衰竭前期進(jìn)展至ACHBLF的動(dòng)態(tài)觀察中,ESR1啟動(dòng)子的甲基化率隨病情的嚴(yán)重程度變化,病情越危急,甲基化率越高。5.Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型提示MELD值、肝性腦病、ESR1啟動(dòng)子的甲基化有可能是預(yù)測(cè)ACHBLF患者28天死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。6.PBMC-ESR 基因啟動(dòng)子的甲基化預(yù)測(cè)ACHBLF早期患者28天生存狀態(tài)的診斷價(jià)值明顯高于MELD評(píng)分24.6(P = 0.015)。結(jié)論P(yáng)BMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化與ACHBLF患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān),可能是預(yù)測(cè)早期ACHBLF患者短期28天生存狀態(tài)的無創(chuàng)性生物學(xué)指標(biāo)。第二部分:血清ESR1、DNMT3b、CDH1基因的甲基化早期診斷HBV相關(guān)肝癌的研究研究背景:肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱肝癌)在我國(guó)惡性腫瘤相關(guān)性死亡中排名第二位,嚴(yán)重影響國(guó)民健康。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一,HBV感染相關(guān)的肝癌又稱為HBV相關(guān)肝癌(HBV-related hepatocellular carcinoma,HBV-related HCC)。盡管肝癌的綜合治療發(fā)展迅速,但5年生存率僅為30%-40%,而HBV-related HCC預(yù)后更差,不到12%。理想的治療效果取決于疾病的早期診斷和合理治療。血清甲胎蛋白和影像學(xué)檢查是目前診斷肝癌的主要檢測(cè)手段,但是甲胎蛋白診斷肝癌時(shí)假陽性和假陰性較高,影像學(xué)檢查在腫瘤體積較小時(shí)存在漏診。因此尋求一種新的腫瘤標(biāo)志物能夠從慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)和 HBV相關(guān)肝硬化(HBV-related Liver cirrhosis,HBV-related LC)患者中早期篩查HBV-related HCC是臨床亟待解決的問題�；騿�(dòng)子的異常甲基化被廣泛用作腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物。HBV基因組編碼的HBx蛋白通過上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,引起基因啟動(dòng)子的高甲基化,表達(dá)下調(diào),擾亂細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡程序,最終導(dǎo)致HBV-related HCC的發(fā)生。HBV-related HCC患者中男性占絕大多數(shù),說明雌激素信號(hào)通路可能具有抑制肝癌發(fā)生的作用。而雌激素只有與雌激素受體(Estrogen Receptor，ESR)(肝臟中以ESR1為主)結(jié)合后才能發(fā)揮抗氧化、抗肝纖維化、抗癌等生物學(xué)效應(yīng),ESR1基因組學(xué)的變異可能促進(jìn)HBV-related HCC的發(fā)生。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methyltransferases 3b.DNT3b)是催化基因新生甲基化的關(guān)鍵酶。CDH1基因編碼的鈣粘附蛋白E,介導(dǎo)基底膜同種細(xì)胞間的連接,鈣粘附蛋白 E表達(dá)減少,細(xì)胞間粘附力降低,腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。既往研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌中存在不同程度的ESR1、DNET3b和CDH1基因啟動(dòng)子的異常甲基化,但是目前并沒有ESR1、DNMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子甲基化的聯(lián)合檢測(cè)作為HBV-related HCC早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道。研究目的通過檢測(cè)對(duì)比HBV-related HCC、HBV-related LC、CHB和健康人(Normal control,NC)血清中ESR1、DNMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率,分析HBV-related HCC進(jìn)展過程中不同基因的異常甲基化與病例資料的相關(guān)性,探討血清基因啟動(dòng)子甲基化的聯(lián)合檢測(cè)用于早期診斷HBV-relatedHCC的可行性。研究方法研究選取2011年1月至2013年5月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院治療的183例肝癌患者作為實(shí)驗(yàn)組,包括153例HBV-related HCC患者和30例非HBV相關(guān)肝癌患者(Non-HBV-related HCC),隨機(jī)選取同一時(shí)間段的47例HBV相關(guān)肝硬化和126例CHB、50例NC作為對(duì)照組。甲基化特異性PCR方法分析不同人群血清ESSR1、DNMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率�？ǚ綑z驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)用于不同組不同基因啟動(dòng)子甲基化率的比較,ROC曲線分析二個(gè)基因甲基化的聯(lián)合檢測(cè)早期診斷HBV相關(guān)肝癌的合理性。研究結(jié)果1.HBV-related HCC 患者血清中ESR1(30.07%)、DNMT3b(41.18%)和CDH1(27.45%)的甲基化率顯著高于HBV-related LC患者(P0.001,P0.001,P =0.007)、CHB患者(P0.001,,P0.001,,P0.001)和NC組(P0.001,P0.001,P0.001)。但是,三個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化率在NC和CHB、NC和HBV-related LC、CHB和HBV-related LC之間差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.Non-HBV-related HCC患者CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率(46.67%)顯著高于HBV相關(guān)肝癌患者(27.45%,P = 0.037),而DNMT3b(P=0.905)和ESR1(P = 0.709)的甲基化率在兩者之間均沒有顯著性差異。3.HBV-related HCC患者合并肝硬化時(shí)ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率顯著高于未合并肝硬化者(= 0.005),手手術(shù)切除組ESR1的甲基化率明顯高于采取其他治療措施組(P= 0.027);DNMT3b的甲基化率在腫瘤直徑大于10厘米的患者中高于3-10厘米患者(P=0.028),單個(gè)結(jié)節(jié)的甲基化率顯著高于多個(gè)結(jié)節(jié)者(P =0.045);男性CDH1的甲基化率明顯高于女性(P = 0.026)。而三個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化均與甲胎蛋白白、e抗原、腫瘤細(xì)胞的分化程度、大血管侵犯、肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶無關(guān)。4.Non-HBV-related HCC患者血清中ESR1甲基化率在AFP ≥ 400 ng/mL組顯著高于AFP400 ng/mL組(P=0.048);DNM 3 的甲基化率在腫瘤直徑小于3厘米的患者中高于3-10厘米患者(P= 0.010);CDH1啟動(dòng)子的甲基化率與性別、年齡、腫瘤直徑、結(jié)節(jié)數(shù)目、e抗原、甲胎蛋白、合并肝硬化、腫瘤細(xì)胞的分化程度、大血管侵犯、肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶、治療方式等均沒有相關(guān)性。5.兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生甲基化的組合中,血清CDH1和ESR1同時(shí)發(fā)生甲基化的概率在HBV-related HCC患者中為21.62%,而在Non-HBV-related HCC患者中這一組合發(fā)生的概率為0。6.從CHB患者中辨別HBV-related HCC時(shí),甲基化聯(lián)合檢測(cè)的敏感性是84.48%,特異性66.26%,陽性預(yù)測(cè)值2.50,陰性預(yù)測(cè)值0.23,曲線下的面積(The area under ROC curves,AUC)顯著高于甲胎蛋白(P=0.003);從HBV-related LC患者中診斷HBV-related HCC時(shí),甲基化聯(lián)合檢測(cè)的AUC明顯高于血清甲胎蛋白(P= 0.045)。結(jié)論1.HBV-related HCC患者血清中較常出現(xiàn)ESR1、DNMT3bCDH1基因啟動(dòng)子的異常高甲基化,血清甲基化的聯(lián)合檢測(cè)可能是早期診斷HBV-related HCC的標(biāo)記物。2.HBV-related HCC和Non-HBV-related HCC相同基因啟動(dòng)子的甲基化率不同,不同基因聯(lián)合檢測(cè)的甲基化率也不同,提示HBV影響肝癌的表觀遺傳學(xué)修飾。
[Abstract]:Acute or subacute hepatitis B liver failure ( ACHBLF ) is a marker of acute or subacute hepatitis B ( ACHBLF ) . The methylation status of ESR1 promoter in patients with ACHBLF was analyzed . The results showed that the methylation rate of PBMC - ESR1 promoter was 66.37 % , 30.97 % and 27.43 % in patients with ACHBLF ( P = 0.003 ) , and the mortality rate was 67.26 % . The methylation rate of PBMC - ESR1 promoter in ACHBLF group was significantly higher than that in non - survival group ( 66.37 % ) . 4 . The methylation rate of ESR1 promoter was significantly lower than that of non - methylation group ( P = 0.044 ) . The methylation rate of ESR1 promoter was higher than that of non - methylation group ( P = 0.044 ) . Conclusion The methylation of the promoter of PBMC - ESR1 gene is related to the degree of severity of ACHBLF , which may be the non - invasive biological indicator for early diagnosis of HBV - related liver cancer in early ACHBLF patients . The second part : Serum ESR1 , DNMT3b , CDH1 gene methylation in the early diagnosis of HBV - related liver cancer research background : hepatocellular carcinoma ( abbreviated as liver cancer ) is one of the important risk factors of liver cancer . The liver cancer associated with HBV infection is also referred to as HBV - related hepatocellular carcinoma ( HBV - related HCC ) . HBV - related hepatocellular carcinoma ( HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis ( HBV - related liver cirrhosis , HBV - related liver cirrhosis ) is a key enzyme for the diagnosis of liver cancer . The methylation rate of ESR1 , DNMT3b and CDH1 in serum of HBV - related HCC patients was analyzed by methylation specific PCR . 3 . The methylation rate of ESR1 gene promoter in patients with HBV - related HCC was significantly higher than that in patients without cirrhosis ( P = 0.027 ) . The methylation rate of DNMT3b was significantly higher than that in patients with liver cirrhosis ( P = 0.028 ) . The methylation rate of DNMT3b was significantly higher than that in patients with cirrhosis ( P = 0.028 ) . The methylation rate of DNMT3b was significantly higher than that in patients with liver cirrhosis ( P = 0.028 ) . The methylation rate of male CDH1 was significantly higher than that of women ( P = 0.026 ) . In patients with non - HBV - related HCC , the methylation rate of serum CDH1 and ESR1 was 21.62 % , specificity 66.26 % , positive predictive value 2.50 , negative predictive value 0.23 , area under curve ( The area under ROC curves , AUC ) was significantly higher than that in serum AFP ( P = 0.003 ) . Conclusion 1 . Abnormal hypermethylation of ESR1 and DNMT3bCDH1 promoter in serum of HBV - related HCC patients may be a marker for early diagnosis of HBV - related HCC .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62;R575.3;R735.7

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10 健康時(shí)報(bào)特約記者　 yび板，

本文編號(hào)：1447761