本文關鍵詞： 細胞凋亡 心肌缺血 心肌細胞 成纖維細胞 心肌纖維化 絲裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶2 MK2 MMI-0100 細胞壞死　出處：《山東大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景及目的缺血性心臟疾病是目前世界上最常見的致死性疾��；在美國,每年有約785000個人發(fā)生心肌梗死,幾乎每分鐘一個人。而梗死后心肌的不可逆重塑是導致梗死后心功能不全乃至心衰的主要原因。雖然介入治療-大多數(shù)是早期的再灌注治療-可以增加患者的生存率,但是導致心功能衰竭的心肌不可逆重塑過程卻無法停止。梗死區(qū)域的大小,梗死部位的恢復以及慢性的左心室重塑決定了最終心力衰竭的程度。為了使梗死后的心力衰竭的程度最小化,在梗死后的早期對梗死區(qū)域進行縮小的治療方案顯得尤為重要。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAP激酶,MAPK)鏈是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一,在基因表達調控和細胞質功能活動中發(fā)揮關鍵作用。在哺乳動物機體中,已經發(fā)現(xiàn)五種不同的MAPK信號轉導通路。其中ERKl/2信號轉導通路調控細胞生長和分化,JNK和p38 MAPK信號轉導通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用。目前已知的是,p38MAPK在致死性的心肌梗死過程中與心肌細胞的死亡,心肌梗死后的心力衰竭、心肌纖維化程度及心肌細胞的肥大密切相關；而絲裂原激活的蛋白激酶激活的蛋白激酶2 (MAPKAPK2或者MK2),作為p38 MAPK在細胞內的下游絲氨酸／蘇氨酸激酶的底物,也在很多炎性疾病導致的瘢痕形成及纖維化過程中有涉及。近期關于MK2-/-小鼠的研究證實了MK2在p38 MAPK通路中的重要作用,并且同時驗證了其與p38誘導的心力衰竭密切相關。此外,MK2-/-小鼠還可以抵抗缺血再灌注的損傷,這些都提示了在缺血性心臟疾病過程中MK2信號通路的重要性。近期的研究報道了一種細胞浸透性的短肽MMI-0100在一個小鼠靜脈移植模型中可以抑制術后炎癥反應以及纖維化(內膜增生),在一個豬的博來霉素誘導肺纖維化模型中可以減輕肺的纖維化程度,在一個腹部手術模型中可以減輕粘連。因此,我們決定對小鼠急性心肌梗死后通過應用MMI-0100抑制MK2信號通路發(fā)揮心肌保護作用的假說進行實驗。基于先前的研究成果,我們的研究對MMI-0100在小鼠體內心肌梗死后降低纖維化范圍的假說進行了體內試驗。我們證實了在標準的冠狀動脈左前降支(LAD)結扎誘導的鼠類心肌梗死模型中MMI-0100在梗死后2周的時間點上降低了心肌纖維化程度。已知MK2信號通路在心肌細胞死亡、成纖維細胞分化以及細胞外基質(其中包括膠原)的分泌(導致纖維化)過程中發(fā)揮重要作用,我們通過體外細胞實驗證實了MMI-0100在是通過對心肌細胞和心肌成纖維細胞兩種不同的細胞分別發(fā)揮作用來實現(xiàn)的心肌保護作用。我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗中,MMI-0100在兩種心肌來源的心肌細胞(H9C2.HL-1)中可以抑制caspase3/7的活性,而在心肌成纖維細胞中卻能夠增強caspase3/7的活性。這些研究結果首次報告了MMI-0100能夠抑制心肌梗死后的心肌纖維化,同時還闡明了其通過抑制MK2活性進而抑制心肌細胞的凋亡的原理,而且還發(fā)現(xiàn)了其通過對于心肌成纖維細胞的直接作用達到減輕心肌纖維化的目的。方法1.動物實驗：(1)我們采用了C57BL/6雄性小鼠的心肌梗死模型進行實驗,心肌梗死模型是通過永久性地結扎冠狀動脈左前降支獲得。我們將小鼠分5組進行實驗：1.心肌梗死組：永久性結扎冠狀動脈前降支但無MMI-0100注射；2.心肌梗死后治療組：永久結扎冠狀動脈前降支后1小時內,經腹膜腔注射MMI-0100,并每日重復注射14天(50μg/kg/day)；3.假手術組：假手術組除了不對冠狀動脈進行結扎外,其他手術步驟完全相同;4.正常對照組：未行手術及藥物注射；5.單純藥物注射組：未行手術但每日重復注射MMI-0100(50μg/kg/day)14天。期間對小鼠的心功能(LVEDD;LVESD;LV Vol:d；LV Vol;s;FS;EF%等指標)進行測定分析,共分三個測量時間點：基點,7天和14天。(2)動物實驗標本的免疫組織化學分析：在實驗終點處死小鼠,獲取小鼠心臟標本并進行石蠟包埋,切片,應用HE染色及Masson's trichrome (MT)染色進行心肌纖維化程度的分析；對組織切片進行vimentin, α-SMA, TGF-β1及TUNEL熒光染色以確定組織中不同細胞組成的改變及對細胞凋亡程度進行測定。2.細胞實驗：(1)原代心肌成纖維細胞及心肌細胞系的培養(yǎng)我們采用H9C2,HL-1兩種心肌細胞系及原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞進行實驗,培養(yǎng)方法嚴格按照已經發(fā)表的操作步驟進行。(2)缺氧環(huán)境的獲得、缺氧時間點的確定以及細胞死亡率的確定。缺氧環(huán)境通過將細胞置入一個缺氧培養(yǎng)箱(使用混合的5%CO2及95%N2提供一個1%氧濃度的缺氧環(huán)境)。每種細胞分3個實驗組：1)0.5%DMSO終濃度組；2) 20μM MMI-0100[溶于終濃度為0.5%的DMSO]組；3) 100μM MMI-0100[溶于終濃度為0.5%的DMSO]組,并取3個實驗時間點。這些時間點根據(jù)在缺氧環(huán)境中細胞的LDH釋放量確定的細胞死亡程度進行選擇：H9C2細胞系：8小時；16小時；24小時；HL-1細胞系：4小時；8小時；12小時；心肌成纖維細胞系：16小時；32小時；48小時。(3)細胞死亡及凋亡的分析使用LDH釋放量測定試劑盒對細胞培養(yǎng)液中的LDH進行測定以確定細胞的死亡率；使用Caspase3/7活性檢測試劑盒對細胞裂解液中Caspase3/7的活性進行測定以確定細胞的凋亡率。(4)MK2活性的免疫印跡分析我們采用了hnRNPAO,MAPK2以及phospho-MAPK2三個指標來對MK2的活性進行分析；(5)細胞培養(yǎng)基中TNF α,IL-1β及IL-6細胞因子的分析。我們對細胞進行處理后的培養(yǎng)基中的TNF α,IL-1β及IL-6等細胞因子進行了定量分析。結果1.急性心肌梗死后體內應用MMI-0100短肽治療可保護心功能并減輕心室擴張。實驗證實：心肌梗死組的左室射血分數(shù)(EF%)較假手術對照組減少了26%,左室短軸縮短率(FS%)減少了37%。而MMI-0100治療組則將這兩項指標的降低分別減少到了12%和20%。MMI-0100還相應地緩解了心梗后典型的左心室容積及其舒張末直徑的增加。而單純MMI-0100治療的對照組顯示其對正常小鼠的心功能和生存率無影響。2.急性心肌梗死后體內應用MMI-0100治療可以通過減少心肌細胞的死亡,同時增加成纖維細胞的死亡來減輕心肌纖維化。(1)動物實驗中,對實驗小鼠的梗死后心肌組織切片進行Masson's trichrome染色的結果證實急性心肌梗死后接受MMI-0100治療的實驗組心肌纖維化程度較非治療組減少了50%。而且我們在對各組中的有代表性的組織切片進行詳盡觀察時還發(fā)現(xiàn),MMI-0100治療組切片在相同層面上的切片中的梗死區(qū)要小,而且在梗死區(qū)內部可見到有小的存活的心肌細胞島。而對組織切片的免疫熒光染色顯示,MMI-0100治療在心梗后可以減少成纖維細胞的數(shù)量,增加動脈密度并且減少了組織切片中TGF-β陽性的細胞。這一點證實MMI-0100可能是通過抑制TGF-β的作用(通過MK2的抑制作用)來實現(xiàn)其降低非梗死區(qū)心肌纖維化程度,從而發(fā)揮保護心功能的作用的。(2)細胞實驗中,心肌細胞來源的H9C2細胞系及HL-1細胞系在低氧處理后caspase3/7的活性都有相應地增強,但在MMI-0100的作用下,這個預示著細胞凋亡信號的指標卻得到了有效的抑制；而原代培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞實驗中,MMI-0100卻顯著增強了caspase3/7的活性。而對細胞裂解液中蛋白表達的分析顯示：在H9C2細胞及HL-1細胞中,MMI-0100在缺氧處理后明顯抑制了hnRNPAO的表達,然而MK2及p-MK2的表達水平都沒有明顯的改變;而大鼠心肌成纖維細胞中,MMI-0100沒有抑制hnRNPAO的表達,MK2及p-MK2的蛋白水平也沒有明顯的改變。而這些研究結果說明MMI-0100在低氧環(huán)境下能夠抑制心肌細胞的凋亡,而同時促進成纖維細胞的死亡,這或許能夠說明MMI-0100在體內實驗中是通過降低了成纖維細胞的活性從而減輕心肌纖維化程度的。結論使用合理設計的細胞浸透性短肽MMI-0100通過抑制絲裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶Ⅱ(MK2)的活性能夠在2周后抑制急性心肌梗死后心肌纖維化程度并保護心臟功能,其機制牽涉了對心肌細胞凋亡的抑制,同時還增加了原代心肌成纖維細胞的死亡。
[Abstract]:Background and Objective Ischemic heart disease is one of the most common fatal diseases in the world . In the United States , there are about 785,000 individuals with myocardial infarction , almost one person per minute . 3 . sham operation group : Except for coronary artery ligation , other surgical procedures were the same ; 4 . Normal control group : no procedure and drug injection ; 5 . Analysis of myocardial fibrosis degree in rats with normal control group : no procedure but repeated injection of MMI - 100 ( 50 渭g / kg / day ) for 14 days . ( 2 ) The cell death and apoptosis were determined by using the serum LDH release assay kit . The results showed that the cell death rate was reduced to 12 % and 20 % . The results showed that the expression of Caspase 3 / 7 in the cells was reduced by 26 % and the decrease of the left ventricular end shortening ( FS % ) was reduced by 37 % . In vivo experiments , the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited in the experimental group , but the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited by the action of MMI - 100 . The mechanism involved the inhibition of myocardial fibrosis and the death of the primary myocardial fibroblasts .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22

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