本文關(guān)鍵詞： 雷帕霉素靶蛋白 冬蟲夏草 病毒性心肌炎 心肌成纖維細(xì)胞 心肌纖維化　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:病毒性心肌炎(viral myocardifis,VMC)病程遷延可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病,心肌纖維化是影響病毒性心肌炎預(yù)后的關(guān)鍵因素。研究病毒性心肌炎心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制,為病毒性心肌炎治療提供理論根據(jù)。冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥,可以調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防腎臟纖維化,是否可以抑制心肌纖維化?是我們選用冬蟲夏草作為抑制心肌纖維化藥物的最初設(shè)想。乳類動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,調(diào)控蛋白質(zhì)的生成,影響細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程,與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān),其靶向抑制劑是雷帕霉素(rapamycin,雷帕霉素),mTOR是否與心肌纖維化相關(guān)?本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞和Balb/c小鼠模型,從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上研究mTOR在病毒性心肌炎心肌纖維化的表達(dá)及作用,以及評(píng)價(jià)冬蟲夏草抗病毒性心肌炎的作用及機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分:(1)mTOR在病毒性心肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)及冬蟲夏草提取物抗病毒性心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用研究材料與方法:體外建立柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)感染心肌成纖維細(xì)胞模型,分為對(duì)照組、CVB3組、雷帕霉素+CVB3組、冬蟲夏草大小不同劑量+CVB3組、冬蟲夏草+雷帕霉素+CVB3組,應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素和冬蟲夏草干預(yù)CVB3感染大鼠心肌成纖維細(xì)胞,通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,RT-PCR檢測(cè)CVB3-m RNA、mTOR-m RNA、TGF-β1 m RNA、膠原I-m RNA、膠原III-m RNA,western印跡檢測(cè)mTOR和mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1、以及TGF-β1、Smad蛋白和膠原-I。結(jié)果:1)CVB3可以感染心肌成纖維細(xì)胞,發(fā)生細(xì)胞病變。2)RT-PCR,qRT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞mTOR/β-actin光密度值,CVB3組高于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。Western Blot檢測(cè)mTOR蛋白以及下游蛋白P-P70S6K、P-4EBP1,CVB3組P-P70S6K高于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組P-P70S6K低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);CVB3組P-4EBP1低于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組P-4EBP1高于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。3)RT-PCR,qRT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞I型膠原光密度值,CVB3組高于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);Western Blot檢測(cè)I型膠原灰度值。CVB3組高于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05);4)RT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1光密度值,Western Blot檢測(cè)TGF-β1和Smad3灰度值,CVB3組高于對(duì)照組,CVB3+雷帕霉素組低于CVB3組,差異均有顯著性(P0.05)。(5)RT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞CVB3 m RNA光密度值:CVB3組可以檢測(cè)到CVB3 m RNA表達(dá),冬蟲夏草組低于CVB3組,差異具有顯著性(P0.05)。6)冬蟲夏草提取物和蟲草素干預(yù)CVB3心肌成纖維細(xì)胞,心肌成纖維細(xì)胞CVB3、mTOR、TGF-β1、膠原-I和膠原m RNA表達(dá)較CVB3組均降低,mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K較CVB3組降低、P-4EBP1較CVB3組升高、TGF-β1、Smad蛋白和膠原-I和膠原 III較CVB3組均降低,差異均具有顯著性(P0.05)。上述作用具有劑量依賴性,大劑量冬蟲夏草效果更明顯。(2)MTOR在病毒性心肌炎慢性期小鼠的表達(dá)及冬蟲夏草抗病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纖維化的作用研究材料與方法:通過(guò)采用CVB3(先后2次從腹腔注射病毒的經(jīng)典方法制造)病毒性心肌炎小鼠慢性期模型。分為正常對(duì)照組、模型組、冬蟲夏草大小劑量組以及卡托普利對(duì)照組,通過(guò)統(tǒng)計(jì)死亡率;實(shí)驗(yàn)60天結(jié)束時(shí)檢測(cè)心肌膠原容積分?jǐn)?shù)CVF(MASSON染色),RT-PCR檢測(cè)心肌mTOR m RNA,western印跡檢測(cè)mTOR、及mTOR下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1,以及TGF、Smad蛋白和心肌組織中膠原-I。結(jié)果:1)CVB3病毒性心肌炎小鼠慢性期動(dòng)物模型建立成功。2)統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡率,模型組小鼠死亡數(shù)目最多,冬蟲夏草大劑量組小鼠死亡數(shù)目最少,空白對(duì)照組沒(méi)有死亡,差異具有顯著性(P0.05)。3)心肌病理顯示模型組小鼠心肌纖維化較對(duì)照組明顯,冬蟲夏草組小鼠纖維化較模型組減輕,存在量效依賴性。4)心肌組織mTOR m RNA及下游標(biāo)志物P-P70S6K、P-4EBP1表達(dá):病毒組mTOR m RNA及下游標(biāo)志物P-P70S6K較正常對(duì)照組明顯升高,P-4EBP1降低,差異有顯著性(P0.01)�？ㄍ衅绽M和冬蟲夏草大劑量組,與病毒模型組相比較MTOR m RNA、P-P70S6K表達(dá)明顯降低,P-4EBP1表達(dá)升高,差異有顯著性(P0.01);而冬蟲夏草大劑量組和小劑量組mTOR m RNA水平相比,劑量依賴性,差異有顯著性(P0.01)。5)心肌組織TGF-β1 m RNA、Smads蛋白表達(dá):病毒模型組的TGF-β1m RNA、Smads蛋白與正常對(duì)照組明顯升高,差異有顯著性(P0.01)。卡托普利組和冬蟲夏草大、小劑量組較病毒模型組明顯降低,差異有顯著性(P0.05),而冬蟲夏草大劑量組和小劑量組mTOR m RNA水平相比,劑量依賴性,差異有顯著性(P0.01)。6)心肌組織膠原-1和膠原-3的表達(dá)。病毒模型組膠原-1和膠原-3的表達(dá)較對(duì)照組均明顯增高,差異有顯著性(P0.01)。卡托普利組和冬蟲夏草大、小劑量組與病毒模型組相比膠原-1表達(dá)明顯降低(P0.05);且冬蟲夏草大劑量組膠原-1表達(dá)量與冬蟲夏草小劑量組相比有下降,差異有顯著性(P0.05)。結(jié)論:1)心肌成纖維細(xì)胞可作為CVB3感染的VMC細(xì)胞模型。2)CVB3病毒性心肌炎慢性期小鼠模型可以作為研究VCM心肌纖維化動(dòng)物模型。3)mTOR信號(hào)通路活化是CVB3誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制之一,雷帕霉素是mTOR作用的靶點(diǎn)。4)從細(xì)胞和動(dòng)物水平顯示mTOR信號(hào)通路參與VCM心肌纖維化,并且可能與TGF-β1、Smad信號(hào)通路相互作用。5)冬蟲夏草具有抗CVB3作用,具有抑制CVB3心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用,具有抗VMC小鼠心肌纖維化、降低VMC小鼠死亡率作用,上述作用具有量效依賴性,大劑量效果更明顯,其機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路,并可能和TGF-β1、Smad信號(hào)通路相互作用抑制心肌纖維化。因此,本研究從體外CVB3心肌成纖維細(xì)胞模型和體內(nèi)CVB3病毒性心肌炎小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明,mTOR通路參與心肌成纖維細(xì)胞增殖和病毒性心肌炎心肌纖維化,冬蟲夏草具有抗VMC纖維化作用,且有劑量依賴性,其作用機(jī)制之一抑制mTOR通路,并可能和TGF-β、Smads通路相互作用,共同參與心肌纖維化。以往的研究表明,VMC心肌纖維化實(shí)際是多個(gè)因素參與的復(fù)雜的生物過(guò)程。本研究結(jié)果從另一個(gè)方面提示,雷帕霉素、冬蟲夏草具有抑制mTOR通路參與抗心肌纖維化作用,為尋找治療VMC心肌纖維化藥物提供理論依據(jù)和新思路。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of myocardial fibrosis induced by viral myocarditis ( CVB3 ) . The expression of TGF - 尾1 , P - 4EBP1 , CVB3 and CVB3 in CVB3 group were higher than those in the control group , and the difference was significant ( P0.05 ) . T-PCR媯，

本文編號(hào)：1446862