本文關鍵詞：miR-140-5p調控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細胞瘤增殖和侵襲的分子機制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腎母細胞瘤(Nephroblastoma),又稱Wilm's瘤,起源于胚胎性組織,是兒童最常見的腹部惡性腫瘤之一,多發(fā)生于5歲以下兒童,中國的發(fā)病率約為3.3每百萬人,其發(fā)病率約占兒童惡性腫瘤的8-10%和兒童腎臟腫瘤95%。近年來,由于綜合治療措施的進步,使得疾病的生存率有了很大提高,目前國際上總生存率可達到70%至80%,甚至更高。但在疾病的末期仍有惡性轉移的可能性,目前該病仍有5%的死亡率。因此,發(fā)現(xiàn)腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,對找到干預腫瘤發(fā)生,發(fā)展的方法和提高腫瘤的治愈率有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類長約17-24個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA,通過與靶mRNA完全或不完全互補配對,導致靶mRNA降解或抑制其翻譯,是一種基因轉錄后的調控。miRNAs與腫瘤密切相關,但是特異性miRNAs如何通過靶基因調控腎母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程的詳細機制還需要進行深入研究。本研究通過miRNAs芯片技術和生物信息學等方法篩選腎母細胞瘤組織中差異表達的關鍵miRNAs,選定miR-140-5p為研究對象,尋找并驗證miR-140-5p的靶基因TGFBR1和IGF1R并進行功能驗證。進一步研究了 miR-140-5p通過調控靶基因TGFBR1和IGF1R所在的信號通路TGF-β和IGF-1來影響腎母細胞瘤的增殖和侵襲的分子機制。目的證實miR-140-5p抑制腎母細胞瘤的增殖和侵襲;明確miR-140-5p通過調控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細胞瘤增殖和侵襲。方法1.采用miRNA表達譜芯片檢測腎母細胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達譜。發(fā)現(xiàn)差異表達miRNAs。2.通過對芯片結果的生物信息學分析和莖環(huán)實時熒光定量PCR方法驗證,最終篩選出miR-140-5p為研究對象。3.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達miR-140-5p的腎母細胞瘤細胞株G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p;MTS法檢測不同處理組細胞的增殖率;流式細胞術分析細胞周期;遷移實驗分析細胞株侵襲能力。4.生物信息學軟件預測miR-140-5p對其關鍵靶基因的調控位點;同時雙熒光素酶報告基因方法驗證miR-140-5p對其關鍵靶基因TGFBR1和IGF1R 3'UTR區(qū)的調控作用。5.ELISA方法檢測細胞上清中FGF9含量,免疫印跡實驗檢測靶基因TGFBR1和IGF1R的表達情況,同時檢測兩者所在的信號通路TGF-β通路的下游蛋白Smad2/3,FGF9,ERK和AKT與IGF-1通路的下游蛋白AKT的表達情況。6.回復實驗驗證miR-140-5p對TGFBR1和IGF1R的特異性抑制作用。7.統(tǒng)計學方法:SPSS 13.0錄入數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標準差,采用獨立樣本t檢驗,計數(shù)資料采用卡方檢驗。*p0.05認為有統(tǒng)計學意義。結果1.miRNA表達譜芯片檢測腎母細胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達譜,發(fā)現(xiàn)大量差異表達miRNAs。生物信息學分析選擇miR-140-5p為關鍵miRNAs。Q-PCR方法擴大樣本驗證miR-140-5p在腎母細胞瘤組織中呈低表達狀態(tài)。2.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達miR-140-5p的腎母細胞瘤細胞株G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p。miRNA 無關序列(miRNA-NC)作為對照組,與對照組相比,過表達G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組增殖率出現(xiàn)明顯降低(p0.05);細胞周期組織在G0/G1期。遷移實驗發(fā)現(xiàn),G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組細胞覆蓋率比miRNA-NC組明顯降低。3.雙熒光素酶報告基因實驗表明miR-140-5p能夠對TGFBR1和IGF1R基因的3'UTR起抑制性調控作用;基因沉默實驗和免疫印跡實驗進一步證實miR-140-5p能夠抑制TGFBR1和IGF1R蛋白的表達。4.與miRNA-NC組相比,免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)G401mim-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組TGFBR1和IGF 1R蛋白的表達出現(xiàn)下降。同時TGFBR1下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達降低;IGF1R及其下游蛋白P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達下降。5.在 G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p細胞中分別回復 TGFBR1 和 IGF1R表達,發(fā)現(xiàn)TGFBR1及其下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT均可以回復表達;IGF1R及其下游蛋白P-AKT也可以回復表達;回復蛋白表達之后細胞的增殖率得到回復。結論1.miR-140-5p在腎母細胞瘤中呈低表達;2.miR-140-5p通過調控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細胞瘤增殖和侵襲。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11

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本文編號：1350943