本文關(guān)鍵詞：miR-140-5p調(diào)控TGF-β和IGF-1信號(hào)通路影響腎母細(xì)胞瘤增殖和侵襲的分子機(jī)制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：腎母細(xì)胞瘤(Nephroblastoma),又稱Wilm's瘤,起源于胚胎性組織,是兒童最常見(jiàn)的腹部惡性腫瘤之一,多發(fā)生于5歲以下兒童,中國(guó)的發(fā)病率約為3.3每百萬(wàn)人,其發(fā)病率約占兒童惡性腫瘤的8-10%和兒童腎臟腫瘤95%。近年來(lái),由于綜合治療措施的進(jìn)步,使得疾病的生存率有了很大提高,目前國(guó)際上總生存率可達(dá)到70%至80%,甚至更高。但在疾病的末期仍有惡性轉(zhuǎn)移的可能性,目前該病仍有5%的死亡率。因此,發(fā)現(xiàn)腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)找到干預(yù)腫瘤發(fā)生,發(fā)展的方法和提高腫瘤的治愈率有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)約17-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,通過(guò)與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯,是一種基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。miRNAs與腫瘤密切相關(guān),但是特異性miRNAs如何通過(guò)靶基因調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。本研究通過(guò)miRNAs芯片技術(shù)和生物信息學(xué)等方法篩選腎母細(xì)胞瘤組織中差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs,選定miR-140-5p為研究對(duì)象,尋找并驗(yàn)證miR-140-5p的靶基因TGFBR1和IGF1R并進(jìn)行功能驗(yàn)證。進(jìn)一步研究了 miR-140-5p通過(guò)調(diào)控靶基因TGFBR1和IGF1R所在的信號(hào)通路TGF-β和IGF-1來(lái)影響腎母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲的分子機(jī)制。目的證實(shí)miR-140-5p抑制腎母細(xì)胞瘤的增殖和侵襲;明確miR-140-5p通過(guò)調(diào)控TGF-β和IGF-1信號(hào)通路影響腎母細(xì)胞瘤增殖和侵襲。方法1.采用miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNAs。2.通過(guò)對(duì)芯片結(jié)果的生物信息學(xué)分析和莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證,最終篩選出miR-140-5p為研究對(duì)象。3.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達(dá)miR-140-5p的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p;MTS法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的增殖率;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;遷移實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞株侵襲能力。4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-140-5p對(duì)其關(guān)鍵靶基因的調(diào)控位點(diǎn);同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因方法驗(yàn)證miR-140-5p對(duì)其關(guān)鍵靶基因TGFBR1和IGF1R 3'UTR區(qū)的調(diào)控作用。5.ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中FGF9含量,免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因TGFBR1和IGF1R的表達(dá)情況,同時(shí)檢測(cè)兩者所在的信號(hào)通路TGF-β通路的下游蛋白Smad2/3,FGF9,ERK和AKT與IGF-1通路的下游蛋白AKT的表達(dá)情況。6.回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-140-5p對(duì)TGFBR1和IGF1R的特異性抑制作用。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:SPSS 13.0錄入數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。*p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁非腫瘤腎組織中的miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)miRNAs。生物信息學(xué)分析選擇miR-140-5p為關(guān)鍵miRNAs。Q-PCR方法擴(kuò)大樣本驗(yàn)證miR-140-5p在腎母細(xì)胞瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)。2.慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定表達(dá)miR-140-5p的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p。miRNA 無(wú)關(guān)序列(miRNA-NC)作為對(duì)照組,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組增殖率出現(xiàn)明顯降低(p0.05);細(xì)胞周期組織在G0/G1期。遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),G401miR-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組細(xì)胞覆蓋率比miRNA-NC組明顯降低。3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-140-5p能夠?qū)GFBR1和IGF1R基因的3'UTR起抑制性調(diào)控作用;基因沉默實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-140-5p能夠抑制TGFBR1和IGF1R蛋白的表達(dá)。4.與miRNA-NC組相比,免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G401mim-140-5p和WT-CLS1miR-140-5p組TGFBR1和IGF 1R蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下降。同時(shí)TGFBR1下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達(dá)降低;IGF1R及其下游蛋白P-AKT蛋白也出現(xiàn)表達(dá)下降。5.在 G401miR-140-5p和 WT-CLS1miR-140-5p細(xì)胞中分別回復(fù) TGFBR1 和 IGF1R表達(dá),發(fā)現(xiàn)TGFBR1及其下游蛋白Samd2/3,P-ERK和P-AKT均可以回復(fù)表達(dá);IGF1R及其下游蛋白P-AKT也可以回復(fù)表達(dá);回復(fù)蛋白表達(dá)之后細(xì)胞的增殖率得到回復(fù)。結(jié)論1.miR-140-5p在腎母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá);2.miR-140-5p通過(guò)調(diào)控TGF-β和IGF-1信號(hào)通路影響腎母細(xì)胞瘤增殖和侵襲。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：1350943