本文關(guān)鍵詞：運動及針刺干預(yù)對骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—自噬反應(yīng)的影響機制研究　出處：《北京體育大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:以CRT、FAM134B和LC3的分子作用為切入點,觀察大負(fù)荷運動后骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)的發(fā)生情況,并分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的變化;觀察針刺干預(yù)對運動大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)的影響,并分析針刺對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損的改善作用;探討骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)的分子機制。方法:以雄性SD大鼠和離體大鼠骨骼肌細(xì)胞(L6細(xì)胞)為研究對象。研究一將大鼠分為安靜對照組和運動組,運動組進行一次持續(xù)下坡跑。研究二將大鼠分為安靜對照組、單純運動組、單純針刺組和運動針刺組,其中運動組和運動針刺組進行一次持續(xù)下坡跑,單純針刺組和運動針刺組施以針刺干預(yù)。各組大鼠又按照運動后不同時間點分為0h、12h、24h、48h和72h組,在對應(yīng)時相取比目魚肌進行指標(biāo)測試。使用熒光探針法測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度([Ca~(2+)]ER)、ELISA法測定Ca~(2+)-ATP酶(SERCA)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)含量;應(yīng)用Western Blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、CRT,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體蛋白FAM134B、自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達;采用免疫熒光雙染結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀測FAM134B與CRT、LC3與CRT的共定位情況;運用免疫膠體金技術(shù)對定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白CRT進行標(biāo)記,電鏡下觀察標(biāo)記CRT的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬體狀態(tài)。研究三分為對照組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(TG)處理組和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理組,同一時間收取細(xì)胞測試各相應(yīng)指標(biāo),并運用免疫共沉淀方法,證實L6細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CRT與自噬受體蛋白FAM134B、FAM134B與自噬標(biāo)志蛋白LC3的相互作用。結(jié)果:(1)大負(fù)荷運動后大鼠骨骼肌[Ca~(2+)]ER急劇下降,SERCA和PDI功能障礙;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、CRT表達上調(diào),峰值出現(xiàn)在運動后即刻;自噬受體蛋白FAM134B和自噬標(biāo)志蛋白LC3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達升高且與CRT共定位增加,峰值出現(xiàn)在運動后12小時;電鏡下可見不同階段的自噬體中聚集CRT的免疫標(biāo)記,以運動后12小時最為明顯。(2)針刺干預(yù)可使運動大鼠骨骼肌[Ca~(2+)]ER、SERCA和PDI含量升高;GRP78和CRT蛋白表達相應(yīng)下調(diào);FAM134B和LC3的轉(zhuǎn)位以及與CRT共定位減少。(3)施加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG處理后,大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、功能障礙,CRT表達上調(diào);FAM134B和LC3轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且與CRT共定位增加;免疫共沉淀結(jié)果顯示CRT與FAM134B、FAM134B與LC3之間相互作用加強。結(jié)論:(1)大負(fù)荷運動可誘導(dǎo)骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子紊亂、功能受損,隨即通過CRT、FAM134B和LC3啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)。(2)運動后針刺可下調(diào)CRT蛋白表達,抑制FAM134B和LC3轉(zhuǎn)位,進而通過有效調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)來緩解骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損。(3)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)的可能機制為:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、功能障礙后,CRT蛋白表達上調(diào),FAM134B選擇性錨定CRT并招募LC3,三者相互作用協(xié)同調(diào)控骨骼肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京體育大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R87

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本文編號：1350852