本文關(guān)鍵詞：酪氨酸激酶抑制劑對腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2樣極化的影響　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 巨噬細胞 M2型極化 STAT6 化療 化療 炎癥 IL-13 血管生成 劃痕修復 腫瘤壞死因子-α 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 肝癌

【摘要】：科學研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型極化在各種類型腫瘤的血管生成、腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移等過程中扮演了重要的角色。在腫瘤組織中,巨噬細胞的不同作用支持著腫瘤的生長或是癌細胞的轉(zhuǎn)移。一些臨床研究顯示,腫瘤相關(guān)巨噬細胞(簡稱TAMs)的高度浸潤與乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌以及宮頸癌的臨床不良預(yù)后之間有相關(guān)性。之前的假說提出了 TAMs參與到機體的抗腫瘤作用當中,但最近許多臨床和科學研究已經(jīng)證明在大多數(shù)情況下TAMs會促進腫瘤的惡性進程。越來越多的研究表明,TAMs具有不同的作用,既可以增加細胞毒性化療藥物、癌細胞靶向抗體及免疫治療藥物的抗腫瘤功效,也有可能發(fā)揮對抗藥物的作用。由于TAMs在癌癥的生長與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著多重的作用,因此,發(fā)展靶向于這些細胞的新策略是非常重要的。而且,靶向TAMs將是一項有前途的治療策略。通常靶向TAMs主要有兩個策略,一方面是減少TAMs在腫瘤組織中的密度;另一方面則是將TAMs的類型從促腫瘤型轉(zhuǎn)化殺滅腫瘤類型。然而,靶向TAMs策略距離在臨床的應(yīng)用仍然有一定的距離,很多問題仍然未解決。因此,有許多實驗仍在開展,目前大部分數(shù)據(jù)顯示該策略可以使腫瘤體積大幅度減小具有較好的治療效果,這些都將為臨床應(yīng)用做鋪墊�？伤苄院彤愘|(zhì)性是巨噬細胞的主要特點,因此在腫瘤微環(huán)境中不同的刺激下,TAMs會極化成為不同類型,發(fā)揮預(yù)防腫瘤或是促進腫瘤的生長的不同作用。在腫瘤中,巨噬細胞主要極化為兩種不同的表型,分別是經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。在非惡性腫瘤中,腫瘤相關(guān)巨噬細胞主要大多數(shù)經(jīng)由干擾素Y(IFN-γ)或脂多糖(LPS)誘導極化成為M1型巨噬細胞,具有釋放促炎癥細胞因子、Th1抗原呈遞以及促進腫瘤溶解的功能。相反地,M2型極化的巨噬細胞具有促腫瘤和抗炎的活性。IL-4,IL-13,IL-10和糖皮質(zhì)激素均可誘導巨噬細胞發(fā)生M2型極化。M2型巨噬細胞可進一步分為三種不同的亞型M2a,M2b和M2c型巨噬細胞。這些極化的不同亞型取決于特定類型配體與受體的相互作用,在調(diào)節(jié)炎癥、免疫和腫瘤抑制中發(fā)揮極其重要的作用。Th2型細胞因子如IL-4、IL-13可誘導M2a型極化;M2b型主要由免疫復合物TLRs激活;糖皮質(zhì)激素和IL-10可激活M2c型巨噬細胞。M2型巨噬細胞高度表達IL-10,IL-1誘餌受體以及IL-1Rα,少量分泌CCL-22,CCL-17,低表達IL-12。IL-13受體激活STAT6信號通路進而增加M2型極化基因轉(zhuǎn)錄如甘露糖受體(Mrc1,幾丁質(zhì)酶3(Chil3,Ym1,抵抗素類似物(Retnla和Fizz1,這些都是M2型極化所必不可少的。TAMs在腫瘤的發(fā)展過程中與M2型巨噬細胞功能類似,具有抗炎功能,能夠促進血管生成和組織重構(gòu)以及抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。STAT6是IL-4/IL-13介導的M2型極化中主要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠顯著調(diào)節(jié)炎癥與過敏反應(yīng)間的平衡。STAT6調(diào)控巨噬細胞M2型極化相關(guān)基因例如Arg1,Mrc1以及Ym1的表達。因此M2型極化的TAMs是很有前途的輔助抗癌治療的靶點。然而,TAMs和腫瘤細胞之間的相互作用相當?shù)膹碗s,而且目前仍未被清楚地闡明。最重要地,TAMs能否增加腫瘤生長仍然存在爭議。過去的幾十年中,一些新型的靶向TAMs的抗癌療法,例如化療、靶向治療、聯(lián)合治療和免疫治療已經(jīng)發(fā)展了起來并且進行著廣泛的實驗。此外,重新極化為M1型巨噬細胞,減少TAMs的募集,抑制TAMs的M2型極化以及阻斷M2型TAMs的促腫瘤功能,都或?qū)⒊蔀榭鼓[瘤的新策略。靶向治療是指新一代旨在干擾特定分子靶點的抗癌藥物,這些靶點通常是一些在腫瘤的生長與發(fā)展中具有重要作用的蛋白。酪氨酸激酶是一類可以調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、遷移、分化和死亡的激酶,因此是一個很有前途的癌癥治療靶點。在本課題研究中,我們考察酪氨酸激酶小分子抑制劑(TKI)如達沙替尼,厄洛替尼,吉非替尼和拉帕替尼是否具有抑制TAMs的M2型極化的活性。最初我們將這四個化合物作用在小鼠巨噬細胞RAW264.7,小鼠骨髓來源的原代巨噬細胞BMDMs,小鼠路易斯肺癌細胞LLCs和人肝癌細胞HepG2上,在這些細胞上進行細胞存活實驗,考察它們細胞增殖的抑制作用。將一系列梯度濃度的藥物作用細胞上,篩選出在這四種細胞中均無嚴重增殖抑制作用的最佳濃度。達沙替尼是一種三磷酸腺苷的競爭性抑制劑,主要作為Src家族和Abl酪氨酸激酶的雙重抑制劑。它也是一種非常有效的ephrin受體家族成員KIT和PDGF受體的抑制劑。在本課題的研究中,我們發(fā)現(xiàn)達沙替尼在Raw264.7和BMDMs細胞上均能有效抑制由IL-13所誘導的巨噬細胞M2型極化。當Raw264.7細胞經(jīng)10ng/ml的IL-13給藥72h,細胞表面標記物CD206的的表達明顯上調(diào)。當同時給予0.038μM的達沙替尼后表面標記物CD206的表達有一定程度的下降。相似地,在BMDMs細胞中也能觀察到表面標記物CD206的表達有類似的變化,其表達隨達沙替尼的濃度的升高而降低。為了進一步證實達沙替尼在M2型極化中的作用,采用了實時定量PCR的方法檢測M2型標記基因的mRNA的水平。與IL-13單用組相比,同時給予0.038μM的達沙替尼后,M2型標志基因Mrc1、Ym1、Fizz1和Arg1的mRNA水平顯著降低。這些結(jié)果證實達沙替尼可抑制IL-13誘導的巨噬細胞M2型極化。厄洛替尼是另一種酪氨酸激酶抑制劑,主要用于治療已經(jīng)擴散到身體其他部位,具有特定類型表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細胞肺癌(NSCLC。在本課題中,我們研究了厄洛替尼對IL-13誘導的巨噬細胞M2型極化的作用。在體外實驗中,厄洛替尼可抑制巨噬細胞M2型極化,具體表現(xiàn)為下調(diào)了 M2表面標志物和M2型標志基因的mRNA水平。由于這個化合物具有良好的抑制巨噬細胞M2型極化的活性,因此我們在不同的腫瘤細胞中開展進一步體外以及體內(nèi)研究。在腫瘤微環(huán)境中IL-13可誘導巨噬細胞發(fā)生替代活化的M2型極化。IL-13與其受體的結(jié)合主要激活了 STAT6和PI3K兩條信號通路。然而,IL-13在巨噬細胞極化方面的作用仍然具有爭議的。TAMs的募集,特別是M2型極化的TAMs在腫瘤發(fā)生中的作用非常重要,因此是腫瘤治療中非常有吸引力的靶點。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)吉非替尼對IL-13誘導的巨噬細胞M2型極化具有抑制作用。吉非替尼,一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑,是一種小分子藥物,被批準用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌。它對多種腫瘤細胞和大部分小鼠移植瘤模型均具有良好的抗腫瘤活性。在體外實驗中,我們證明了吉非替尼能夠顯著抑制由IL-13誘導的巨噬細胞的M2型極化,主要表現(xiàn)為M2表面標記物CD206和CD163的下調(diào)和M2型標記基因Mrc1,Arg1,Ym1和Fizz1的mRNA水平的下調(diào)。進一步,我們通過劃痕實驗測定不同條件培養(yǎng)基對LLCs細胞的運動能力的影響,從而分析吉非替尼對巨噬細胞促血管生成功能的影響。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-13處理的巨噬細胞的條件培養(yǎng)基在24h的時候能夠促進LLC細胞的運動能力,而同時給予IL-13和吉非替尼合用的條件培養(yǎng)基組并沒有這個現(xiàn)象,單用吉非替尼處理的巨噬細胞的條件培養(yǎng)基也沒有這個效果。通過transwell實驗考察LLC和RAW264.7細胞在不同條件培養(yǎng)基中的遷移能力的變化,實驗結(jié)果顯示,經(jīng)IL-13處理的巨噬細胞條件培養(yǎng)基能夠促進LLC和RAW264.7細胞的遷移,而同時給予吉非替尼組的條件培養(yǎng)基沒有該促進作用。緊接著,我們發(fā)現(xiàn),吉非替尼在抑制IL-13誘導的M2型巨噬細胞極化過程中,抑制STAT6的磷酸化。巨噬細胞極化主要通過PI3K/Akt、Mapk/Erk和p38通路。而吉非替尼也可以降低Akt,Erk1/2,P38的磷酸化。AMPKα是小鼠巨噬細胞表達的主要亞基,我們進一步考察在IL-13誘導的巨噬細胞M2型極化過程中,給予或是不給予吉非替尼,AMPKα和其下游信號通路ACC磷酸化水平的變化。在RAW264.7細胞中,給予IL-13并不會影響AMPKα和ACC蛋白的磷酸化水平。然而吉非替尼給予后,則能顯著引起AMPKα和ACC的磷酸化水平上調(diào),同時增加IL-13誘導的巨噬細胞M2型極化中AMPKα和ACC的磷酸化。在體內(nèi)實驗中,我們證明了吉非替尼通過抑制腫瘤組織中巨噬細胞M2型極化從而有效地抑制了 LLC腫瘤的轉(zhuǎn)移。吉非替尼能夠顯著降低腫瘤組織中CD206陽性細胞的百分比和巨噬細胞M2型標記基因Mrc1,Arg1和Fizz1的mRNA水平,但不影響腫瘤生長以及不改變腫瘤組織TAMs的數(shù)量。與對照組相比,吉非替尼顯著降低了 CD68,CD206陽性細胞的比例,并且減少了 M2型極化的巨噬細胞在腫瘤組織中的浸潤。我們的研究表明,吉非替尼在體內(nèi)和體外均能有效地抑制巨噬細胞M2型極化并且顯著降低Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移。因此,我們認為吉非替尼可以通過影響巨噬細胞的生物學特點調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境,從而為吉非替尼抗腫瘤功能闡明了新的機制。本課題的研究揭示了吉非替尼新的作用機制,為提高肺癌治療效果提供新的思路,在未來可以通過抑制巨噬細胞M2型極化治療肺癌。肝癌(HCC)與炎癥高度相關(guān)。在HCC微環(huán)境的髓樣細胞中,均存在著大量德爾腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)和髓源性抑制細胞(MDSC,而且常與不良預(yù)后有關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAMs及其啟動信號轉(zhuǎn)導通路在肝細胞癌的治療中是潛在的靶點。在腫瘤環(huán)境中MMP-9表達的增加被認為可以通過降解細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜,釋放基質(zhì)結(jié)合生長因子和促腫瘤生長因子從而促進腫瘤的侵襲和血管生成能力。IL-13被確定為誘導巨噬細胞替代型極化的典型細胞因子。為了建立巨噬細胞替代型極化的體外模型,我們在RAW264.7細胞培養(yǎng)體系中加入10ng/ml的IL-13。在實驗中,我們根據(jù)M2型表面標記物CD206和CD163的表達降低確定拉帕替尼能夠顯著抑制IL-13所誘導的巨噬細胞M2型極化。有研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細胞能夠分泌MMP-9,不過IL-13誘導的巨噬細胞和MMP-9產(chǎn)生之間的聯(lián)系卻并沒有明確的報道。隨后,在肝癌細胞中我們發(fā)現(xiàn)IL-13可以增加MMP-9產(chǎn)生以及M2型標記基因Arg1,Mrc1,Ym1,ILI0,Fizz1和CCL2的表達增加。有趣的是,在實驗中若細胞沒有被IL-13活化則拉帕替尼對MMP-9的產(chǎn)生沒有影響。拉帕替尼抑制IL-13誘導的RAW264.7巨噬細胞的M2型極化。IL-13信號通路可以激活STAT6的磷酸化,在M2型極化中具有重要的作用。此外,Arg-1的表達被證實是由STAT6決定的。拉帕替尼隨著時間的推移顯著降低Arg-1的表達。進一步我們通過western blot證實Arg1與Mrc1表達水平的變化。拉帕替尼可以顯著地降低IL-13誘導的Mrc1和Arg1的表達。這些體外實驗結(jié)果表明,拉帕替尼通過STAT6依賴途徑顯著地抑制IL-13誘導的M2型巨噬細胞極化。PI3K/Akt通路的激活與腫瘤的存活率,侵襲能力和多種腫瘤的不良預(yù)后有著密切的聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)拉帕替尼有效地降低Akt的磷酸化水平。進一步的侵襲實驗中,在與給予拉帕替尼作用的RAW264.7條件培養(yǎng)基共孵育后,可以減少肝癌細胞的血管生成以及降低其轉(zhuǎn)移能力。我們考察了拉帕替尼對巨噬細胞和腫瘤細胞相互作用的功能的影響。分別單獨或者共同給予IL-13和拉帕替尼作用于巨噬細胞72小時,然后更換為新鮮無血清培養(yǎng)基24小時后,將各組的上清收集起來作為條件培養(yǎng)基。為了排除條件培養(yǎng)基對腫瘤存活的影響,我們將條件培養(yǎng)基作用于HepG2細胞24h,并進行細胞存活分析。結(jié)果顯示,四個組別之間對肝癌細胞HepG2存活的作用并沒有顯著差異,均不影響其存活。給予IL-13刺激的巨噬細胞組的條件培養(yǎng)基在24h時顯著促進了 HepG2細胞的遷移,而同時給予拉帕替尼合用組的條件培養(yǎng)基則沒有這樣的現(xiàn)象,同樣地,單用拉帕替尼的組也沒有此現(xiàn)象。拉帕替尼減少了 RAW264.7細胞或骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)中Arg1的表達。使用骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)證實了拉帕替尼可以下調(diào)M2型標志基因Mrc1,Arg1,Ym1,Fizz1,CCL2的mRNA表達水平以及可以減少MMP-9的產(chǎn)生。結(jié)果表明,拉帕替尼可能通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中巨噬細胞蛋白酶的表達水平以及M2型極化從而抑制腫瘤細胞的侵襲能力。結(jié)果還表明,拉帕替尼可能作用于IL-13誘導產(chǎn)生的促腫瘤侵襲以及腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞與腫瘤細胞之間的相互作用。巨噬細胞極化與酪氨酸激酶抑制劑抗腫瘤效果的相關(guān)性。將M2型極化盡可能轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型極化會是對抗實體瘤的有效治療手段�？偠灾�,靶向腫瘤微環(huán)境中的TAMs是未來研究一個方向,而且在未來抑制巨噬細胞M2型極化從而治療癌癥的也將是有效方案。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R73-3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Min-Jing Li;Yan-Cun Yin;Jiao Wang;Yang-Fu Jiang;;Green tea compounds in breast cancer prevention and treatment[J];World Journal of Clinical Oncology;2014年03期

2 Xinguo JIANG;;乳腺癌的免疫調(diào)節(jié)治療(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2014年01期

，

本文編號：1350186