本文關(guān)鍵詞：3D生物支架材料對干細胞細胞活性及成骨分化的影響和相關(guān)通路研究　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景:骨組織工程現(xiàn)已被廣泛用于治療骨缺損性疾病,如骨折、骨髓炎,骨肉瘤等。骨組織工程在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用,主要包括顱頜面的骨缺損,種植技術(shù)等。骨組織工程主要包括三個基本要素:干細胞,生長因子和支架材料。其中,生物支架材料作為原始自體骨和異體骨的替代品,已經(jīng)被大量投入臨床應(yīng)用。理想型的生物支架材料一般具備四大要素:一、生物相容性:這種性質(zhì)主要由材料本身的物理化學特性決定,尤其是支架材料表面的親和力。二、生物降解性:理想的骨性支架材料的降解速度應(yīng)和骨形成的速度一致。三、多孔性:與松質(zhì)骨類似,支架材料的多孔性可促進細胞滲透,營養(yǎng)擴散和骨增長。四、機械強度:生物支架材料的機械強度包括韌性,楊氏模量,抗拉強度,抗壓強度,剪切模量和疲勞強度等。理想的材料機械強度是模擬宿主骨組織本身的機械強度,并存在個體差異。隨著3D打印技術(shù)和納米科技的發(fā)展,將四種要素最優(yōu)化的理想型生物支架材料的研發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。氧化石墨烯作為一種新型的納米材料已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域,如質(zhì)譜儀、藥物傳遞及傳感器等。前期的研究發(fā)現(xiàn),氧化石墨烯可以包被在多種生物支架材料表面,像人工合成聚合物、生物陶瓷及玻璃等,對細胞的增殖和成骨分化具有促進作用。但將氧化石墨烯與鈦金屬類生物支架材料結(jié)合的相關(guān)研究有限。并且,基于口腔種植技術(shù)的生物學基礎(chǔ),研究此種復合生物材料對人牙周膜干細胞(PDLSCs)的生物學活性和成骨分化的影響,將會促進口腔種植體的優(yōu)化和提高種植技術(shù)的成功率�；谝陨闲再|(zhì)的另一種聚合物類支架材料,膠原糖胺聚糖生物支架材料(CG-GAG)獲得越來越廣泛的關(guān)注。多孔結(jié)構(gòu)的膠原糖胺聚糖生物支架已被用于各種組織工程,在體內(nèi)作為皮膚、外周神經(jīng)、軟骨和骨的再生支架材料以及體外作為3D微環(huán)境探討細胞行為和細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用。膠原糖胺聚糖支架具有孔微結(jié)構(gòu),同時可以阻止細胞介導的收縮和瘢痕組織合成,并且能夠支持細胞附著,細胞增殖,有效的代謝物轉(zhuǎn)運和功能性細胞外基質(zhì)的合成。我們實驗室前期研究表明,膠原糖胺聚糖支架與聚乳酸-羥基乙酸共聚物相比,能促進人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)礦化。但細胞接種后的膠原糖胺聚糖支架在培養(yǎng)過程中明顯收縮。為進一步優(yōu)化CG-GAG支架材料,合成了礦化膠原糖胺聚糖(MC-GAG)支架材料。使用共沉淀方法誘導納米級磷酸鈣晶體(nCaP)與膠原和糖胺聚糖沉淀在膠原原纖維上形成納米顆粒礦化內(nèi)容物。與單獨的CG-GAG支架材料相比,MC-GAG支架材料的收縮率略有降低。磷酸鈣沉積到膠原支架主要可提供兩種促進成骨因素:增加支架的機械強度和Ca、P離子選擇性洗脫到細胞培養(yǎng)液中。用于誘導骨形成的最常見的生長因子家族之一是骨形態(tài)蛋白(BMPs)家族。BMPs在細胞內(nèi)以二聚化的前體蛋白形式存在。在二聚化時,前體蛋白在共有Arg-x-x-Arg位點切割,產(chǎn)生分泌的羧基末端成熟二聚體。從細胞分泌后,BMP二聚體通過結(jié)合BMP受體(BMPR)復合物激活細胞內(nèi)的反應(yīng)。BMP受體分為兩型,Ⅰ型BMP受體包括ALK1、ALK2(ActR-1)、ALK3(BMPR-IA)和 ALK6(BMPR-IB);Ⅱ 型 BMP 受體包括BMPR-Ⅱ、活化的ActR-Ⅱ和AcR-ⅡB。不同的細胞類型,BMP受體表型發(fā)揮的作用也不同。根據(jù)BMPR寡聚化的方法,可能發(fā)生典型或非典型途徑的活化。在典型的BMPR通路,受體Smads被招集和磷酸化。磷酸化受體Smads與co-Smad(Smad4)結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細胞核以激活各種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在非典型途徑中,有ERK、p38 MAPK和JNK通路的激活發(fā)生。ERK和p38 MAPK都具有靶向受體Smads用于蛋白酶體降解的能力。我們實驗室前期研究外源BMP-2刺激作用于膠原糖胺聚糖支架材料(CG-GAG)和礦化的膠原糖胺聚糖支架材料(MC-GAG)對人間充質(zhì)干細胞hMSCs成骨分化的影響。有趣的是,數(shù)據(jù)顯示MC-GAG支架不受外源添加BMP-2生長因子的影響。雖然添加BMP-2導致hMSCs堿性磷酸酶表達的適度增加,但在其他成骨基因或礦化的表達中沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。進一步研究發(fā)現(xiàn),典型的BMP受體信號通路中的Smads(Smadl/5)分子在接受或不接受BMP-2刺激的情況下,在MC-GAG支架材料中始終處于磷酸化的激活狀態(tài)。與此相反,在CG-GAG支架中,只有依賴于外源性的BMP-2刺激,Smadl/5分子才能磷酸化而被激活。同時,在檢查三個非典型BMP受體信號通路分子時,只有ERK1/2信號通路在CG-GAG和MC-GAG支架材料中存在差異。在CG-GAG支架中,與MC-GAG支架材料相比,發(fā)現(xiàn)更大量的磷酸化的ERK1/2,特別是在早期的時間點。在第14天和第24天,CG-GAG和MC-GAG支架材料受到BMP-2刺激后均降低了磷酸化ERK1/2的表達。實驗?zāi)康?研究氧化石墨烯鈉鈦板對人牙周膜干細胞的細胞活性和成骨分化的影響。研究膠原糖胺聚糖和礦化膠原糖胺聚糖支架材料對人間充質(zhì)干細胞的細胞活性和成骨分化的影響。并進一步明確膠原糖胺聚糖支架材料中間充質(zhì)干細胞成骨分化的BMP受體介導的相關(guān)信號通路研究。實驗方法:第一部分實驗:通過自組裝技術(shù)合成氧化石墨烯包被的NaOH處理后的鈦板(GO-Ti),通過掃描電鏡,拉曼光譜和原子力顯微鏡檢測GO-Ti的物理性能。然后將人牙周膜干細胞接種到氧化石墨烯鈉鈦板支架材料表面,培養(yǎng)1、3、7、10和14天后收集細胞。通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài),MTT檢測細胞增殖,ALP試劑盒檢測堿性磷酸酶活性,Western blot檢測BSP、RUNX2和OCN的蛋白表達及RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達。第二部分實驗:膠原糖胺聚糖和礦化膠原糖胺聚糖支架材料交聯(lián)后,通過掃描電鏡和EDX能譜分析材料本身機械性能和孔徑大小。在CG-GAG和MC-GAG兩種支架材料中接種人間充質(zhì)干細胞hMSCs后培養(yǎng)3天、14天、28天和56天,收集細胞。Micro-CT檢測hMSCs的礦物質(zhì)沉積,HE染色觀察hMSCs的形態(tài)和分布,RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因如ALP、OCN、RUNX2和COL-Ⅰ的表達。第三部分實驗:主要研究在膠原糖胺聚糖支架材料中調(diào)節(jié)hMSCs成骨分化的BMP受體介導的信號通路。第一節(jié),研究BMP受體通路抑制劑對人間充質(zhì)干細胞的毒性,特異性和成骨分化的影響。在hMSCs的細胞礦化誘導液中加入不同濃度梯度的BMP受體信號通路抑制劑,光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài),茜素紅染色觀察細胞礦化,Western blot檢測特異性通路蛋白的表達和對其他信號通路的作用。第二節(jié)實驗研究在礦化膠原糖胺聚糖支架材料中特異性阻斷BMPR介導的Smad和ERK信號通路對人間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響。接種人間充質(zhì)干細胞后分別加入DMH1(Smad通路抑制劑)和PD98059(ERK通路抑制劑)50uM培養(yǎng)3天、14天、28天和56天后收集細胞。RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2和BSPⅡ的表達;WST-1檢測hMSCs的細胞活性;Micro-CT檢測hMSCs的成骨分化和礦物質(zhì)沉積;HE和茜素紅染色檢測hMSCs的細胞形態(tài)和礦化;Western blot檢測信號通路Smadl/5、ERK、JNK、p38和AKT磷酸化的蛋白和總蛋白的表達以及RUNX2的蛋白表達。實驗結(jié)果:第一部分主要研究氧化石墨烯鈉鈦板(GO-Ti)對人牙周膜干細胞的細胞活性和成骨分化的影響。拉曼和原子力數(shù)據(jù)都顯示氧化石墨烯鈉鈦板表面的氧化石墨烯的純度優(yōu)良。掃描電鏡結(jié)果顯示對照組鈉鈦板基板(Na-Ti)表面呈疏松多孔狀,氧化石墨烯在鈉鈦板表面呈單層片狀分布。MTT結(jié)果顯示GO-Ti與基板對照組Na-Ti相比,促進了人牙周膜干細胞的增殖活性,證明GO-Ti材料本身具有良好的生物相容性。進一步觀察GO-Ti表面人牙周膜干細胞的細胞形態(tài),細胞伸展良好,細胞間多建立細胞連接并與底板間建立了突觸連接。細胞形態(tài)變化,GO-Ti表面的細胞形態(tài)較Na-Ti略短粗,細胞分布密集且表達更多的F-肌動蛋白。結(jié)合RT-PCR,Western blot和堿性磷酸酶活性結(jié)果,GO-Ti促進了成骨相關(guān)基因ALP、BSP、COL-Ⅰ、RUNX2和OCNmRNA的表達,提高了 BSP、RUNX2和OCN蛋白的表達和堿性磷酸酶的活性。第二部分主要研究了膠原糖胺聚糖和礦化膠原糖胺聚糖支架材料的基本性能包括孔徑大小和膠原支架形態(tài)分布以及對hMSCs的細胞活性和成骨分化的作用。MC-GAG在CG-GAG支架材料的基礎(chǔ)上,通過納米顆粒技術(shù)滲入磷酸鈣顆粒,使支架材料本身的性能更貼近于自然的骨組織結(jié)構(gòu)。MC-GAG與CG-GAG支架材料相比,Micro-CT顯示,MC-GAG中本身的礦化程度明顯高于CG-GAG,并且接種hMSCs后培養(yǎng)4周和8周后,兩種材料的礦化程度均增高。礦化物質(zhì)在MC-GAG支架材料中均勻分布,而在CG-GAG中分布集中在材料的邊緣。RT-PCR檢測成骨分化相關(guān)基因,hMSCs的ALP、OCN和RUNX2 mRNA在MC-GAG中的表達量均顯著高于CG-GAG。證明MC-GAG支架材料能更好的促進hMSCs成骨分化和礦物鹽沉積,在骨組織工程中有更廣闊的應(yīng)用前景。第三部分,我們比較了幾種BMP受體信號通路抑制劑對hMSCs的細胞毒性,信號通路特異性,最適濃度和對其他通路的作用。比較選擇出DMH1 50uM用于抑制典型BMP受體Smads信號通路和PD98059 50uM用于抑制非典型BMP受體信號通路中的ERK信號通路。為進一步研究CG-GAG和MC-GAG中hMSCs分化介導的信號通路實驗做準備。將hMSCs接種到CG-GAG和MC-GAG支架材料中,分別加入DMH1和PD98059抑制劑后培養(yǎng)3天、14天、24天和56天后收集細胞。Western blot結(jié)果顯示DMH1抑制了 P-Smadl/5的表達,對其他信號通路P-ERK、P-JNK、P-p38和P-JNK的表達無抑制作用。并且DMH1抑制了 CG-GAG和MC-GAG支架材料中成骨分化蛋白RUNX2的表達。然而PD98059顯著抑制了 P-ERK和P-JNK的表達,對P-Smad、P-p38和P-Akt則無明顯抑制作用。Micro-CT和茜素紅染色結(jié)果均顯示DMH1在CG-GAG和MC-GAG兩種支架材料中均顯著抑制了 hMSCs的成骨分化活性和礦物質(zhì)的沉積。而PD98059抑制劑,只抑制了 CG-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化,而對MC-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化活性則沒有明顯抑制作用。進一步對比相關(guān)成骨基因ALP、RUNX2 和 BSPⅡ mRNA 的表達,ALP 和 BSPⅡ mRNA 在 DMH1 和 PD98059 的作用下,均有所降低。只有RUNX2 mRNA的表達在DMH1和PD98059中存在顯著性的差異。DMH1抑制了 CG-GAG和MC-GAG支架中hMSCs RUNX2 mRNA的表達。而PD98059對CG-GAG和MC-GAG支架中hMSCs RUNX2 mRNA的表達則沒有明顯抑制作用。綜上,典型BMP受體信號通路Smads對CG-GAG和MC-GAG支架材料中hMSCs的成骨分化起主要調(diào)控作用。而非典型BMP受體信號通路ERK和JNK在CG-GAG支架材料中也調(diào)控hMSCs細胞的成骨分化。但MC-GAG中hMSCs細胞的成骨分化則不受非典型BMP受體信號通路的調(diào)控。并且,RUNX2在CG-GAG和MC-GAG支架材料中獨立于非典型BMP受體信號通路的調(diào)控。結(jié)論:氧化石墨烯鈉鈦板有良好的生物相容性,促進了人牙周膜干細胞的細胞增殖和成骨分化,將在口腔種植領(lǐng)域有更好的臨床應(yīng)用。礦化的膠原糖胺聚糖支架材料能更好的促進人間充質(zhì)干細胞成骨分化和礦物鹽沉積,并獨立于非典型BMP受體信號通路的調(diào)節(jié),在骨組織工程中有更廣闊的應(yīng)用前景。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R783.1
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本文編號：1326858