本文關(guān)鍵詞：人體5-吡咯啉羧酸還原酶突變體結(jié)構(gòu)與功能研究　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：摘要 5-吡咯啉羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase,P5CR1)是由 PYCR1基因編碼,以NAD(P)H為輔助因子催化5-吡咯啉羧酸還原為脯氨酸的管家蛋白。脯氨酸和5-吡咯啉羧酸循環(huán)與氨基酸代謝、線粒體細(xì)胞內(nèi)氧化平衡及凋亡功能有關(guān)系。錯義P5CR1 SNPs(nonsynonymous SNPs,nsSNPs)引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化。有報道P5CR1 R119G突變引起結(jié)締組織疾病,導(dǎo)致嚴(yán)重皮膚松弛癥(cutis laxa),這一突變影響了線粒體和結(jié)締組織功能,促進大量凋亡發(fā)生,這使線粒體功能受損害。本研究通過同源模建及表達純化構(gòu)建R119G突變體結(jié)構(gòu),比較野生型和P5CR1 R119G突變體結(jié)構(gòu)和功能差異。心臟和瓣膜組織是由結(jié)締組織成分組成,我們選取心血管疾病(擴心病、冠心病、高心病、房間隔缺損、室間隔缺損和動脈導(dǎo)管未閉)在P5CR1基因和轉(zhuǎn)錄水平進行研究,探索P5CR1突變是否和心血管疾病有關(guān)系,及P5CR1在風(fēng)濕性心臟病二尖瓣狹窄的病理機制。本研究包括如下三部分:1.源于人類P5CR1SNP突變體結(jié)構(gòu)和功能研究;2.點突變對P5CR1功能的影響;3.P5CR1在云南省不同民族轉(zhuǎn)錄本形式及其突變在心血管疾病篩查。第一部分源于人類P5CR1 SNP突變體結(jié)構(gòu)和功能研究[目的]P5CR1 R119G SNP與皮膚松弛發(fā)病機制有關(guān),然而它的結(jié)構(gòu)(分子基礎(chǔ))和功能仍不清楚。為了闡明R119G突變對P5CR1結(jié)構(gòu)與功能影響。參照野生型的P5CR1結(jié)構(gòu)研究這個位點突變對單體、復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能影響,通過計算機模擬方法比較突變體和野生型結(jié)構(gòu)和功能差異。[方法]我們采取了計算機方法檢測了 nsSNPs對P5CR1結(jié)構(gòu)和功能影響。在348個確認(rèn)的SNPs中,根據(jù)SIFT和PolyPhen工具預(yù)測有害性有nsSNPs,用I-突變和分子對接進行R119G突變蛋白的穩(wěn)定性及與輔助因子結(jié)合親和力變化,分子動力學(xué)(molecular dynamics,MD)模擬和本質(zhì)動力學(xué)評估R119G突變對P5CR1蛋白單體和P5CR1-NAD+復(fù)合物結(jié)構(gòu)動力學(xué)改變,結(jié)合自由能計算比較野生型和R119G突變體P5CR1復(fù)合物與NAD+結(jié)合親和力變化。[結(jié)果]在348個確認(rèn)的SNPs中15個具有危害性。用I-突變和分子對接進行了計算機分析,結(jié)果顯示R119G突變導(dǎo)致蛋白的穩(wěn)定性下降及減少了與輔助因子結(jié)合的親和力。分子動力學(xué)(molecular dynamics,MD)模擬結(jié)果顯示R119G突變增加了 P5CR1結(jié)構(gòu)的剛性,尤其是在輔助因子的結(jié)合位點,這將可能減少輔助因子進出的動力學(xué)。R119G突變體剛性的增加很可能的原因是內(nèi)部原子相互作用增加及動態(tài)氫鍵數(shù)目的減少。野生型和R119G突變體P5CR1-NAD+復(fù)合物結(jié)構(gòu)的分子動力學(xué)模擬和本質(zhì)動力學(xué)(essential dynamics,ED)結(jié)果提示R119G突變減少了 P5CR1柔性,尤其是底物與NAD+結(jié)合口袋,這表明這個位點突變減少了輔助因子進出動力學(xué)。MM-PBSA計算結(jié)果表明,與野生型比較,R119G突變體與輔助因子NAD+結(jié)合親和力是減弱的,這也表明這個位點突變可能影響了 P5CR1活性功能。[結(jié)論]通過計算機預(yù)測發(fā)現(xiàn)P5CR1 R119G突變體影響了 P5CR1結(jié)構(gòu)和功能,尤其是影響了 P5CR1與NAD+結(jié)合口袋。第二部分點突變對P5CR1功能的影響[目的]R119G這個位點突變對P5CR1蛋白酶的結(jié)構(gòu)與活性影響仍沒有通過實驗進行闡明。因此我們構(gòu)建R119G突變體載體,比較野生型和R119G突變體P5CR1蛋白酶的活性參數(shù)。[方法]通過克隆、表達R119G突變體P5CR1蛋白,通過鎳柱和分子篩進行蛋白純化,通過紫外分光光度計進行酶活性參數(shù)(Km、Vmax、Kcat、Kcat/Km)測定。[結(jié)果]相對于野生型,R119突變?yōu)镚減少了對底物3,4脫氫左旋脯氨酸的催化效率及對輔助因子結(jié)合親和力。突變體和野生型酶的活性研究結(jié)果顯示酶的孵育溫度在5℃-37℃時突變體的活性是下降的,提示這個位點突變對溫度穩(wěn)定性是下降的。在37℃幾乎沒有剩余活性。表明在體內(nèi)突變體損害了 P5CR1的功能。相反,野生型在37℃是仍有活性,在75℃時幾乎失去活性。通過這些實驗結(jié)果表明R119突變成G可能損害了 P5CR1的功能。[結(jié)論]我們的研究結(jié)果強調(diào)了“chargedpocket”對P5CR1蛋白結(jié)構(gòu)與功能影響。第三部分P5CR1在云南省不同民族轉(zhuǎn)錄本形式及其突變在心血管疾病篩查[目的]皮膚松弛是一個結(jié)締組織疾病,心臟和瓣膜組織是由結(jié)締組織成分組成。皮膚松弛相關(guān)突變基因通過SIFT和PolyPhen預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)A257T、R251H、G206W、A179T、R119H、R119G危害性是高的,根據(jù)這些位點突變我們進行設(shè)計了 2對PCR引物,測序驗證這些位點突變是否和心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)有關(guān)系。探索P5CR1轉(zhuǎn)錄本在云南省不同民族分布情況及其是否與心血管疾病有關(guān)系。驗證P5CR1轉(zhuǎn)錄缺失體對P5CR1蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。對風(fēng)濕性心臟病(rheumatic heart disease,RHD)和非風(fēng)濕性心臟病(non-rheumatic heart disease,nRHD)瓣膜P5CR1蛋白進行研究,初步探討P5CR1在風(fēng)濕性心臟病二尖瓣狹窄的發(fā)病機制。[方法]我們選取心血管疾病197例;擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)40例和冠心病64例,先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)93例,包括房間隔缺損(atrial septum defect,ASD)66 例、室間隔缺損(ventricular septal defect,VSD)11 例和動脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus,PDA)16 例。從這些患者中抽取外周血提取DNA,進行PCR擴增、測序。選取少數(shù)民族人群,先天性心臟病11例,和漢族人群58例,先天性心臟病15例,高血壓心臟病10例,冠心病30例,健康對照3個病例,外周血提取RNA,逆轉(zhuǎn)cDNA,以cDNA為模板進行PCR后測序。對風(fēng)濕性心臟病和非風(fēng)濕性心臟病瓣膜組織P5CR1蛋白進行免疫印跡和免疫組化。[結(jié)果]測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)一例房間隔缺損的患者存在C-T突變,在內(nèi)含子區(qū)。我們發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本形式,是在第五個外顯子缺失(命名缺失體),與野生型比較少了 93個堿基,編碼31個氨基酸。58例漢族人群都是以這個缺失體形式存在,納西族1例和佤族2例是全長cDNA。苗族1例、回族1例和白族1例存在缺失體,然而傣族2例(1例存在缺失體,1例存在全長cDNA),彝族3例(1例存在缺失體,2例存在全長cDNA),說明有的少數(shù)民族只存在缺失體形式,有些少數(shù)民族既存在缺失體也存在全長cDNA。這些結(jié)果提示DNA轉(zhuǎn)錄本在云南不同民族具有差異性。實驗結(jié)果提示缺失體蛋白的催化效率類似于野生型的蛋白,然而缺失體蛋白對溫度耐受性是下降的。發(fā)現(xiàn)瓣膜組織存在P5CR1基因和蛋白表達,免疫組化結(jié)果提示風(fēng)濕性心臟病二尖瓣纖維化程度有加重趨勢。[結(jié)論]P5CR1蛋白可能與風(fēng)濕性心臟病二尖瓣纖維化程度有關(guān)系。P5CR1轉(zhuǎn)錄缺失體形式在不同民族具有差異性。缺失體蛋白酶催化效率類似于野生型蛋白。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1326350