本文關(guān)鍵詞：IARS2基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及功能研究　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一,但其發(fā)病機(jī)制未明,以現(xiàn)有手術(shù)、放療、化療等治療手段進(jìn)行治療,預(yù)后不佳。所以,積極尋找結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制,尤其是努力找尋可提供早期診斷線索的生物標(biāo)記物,對于該病的防治意義重大。目前的研究顯示：結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程可能牽涉到多個(gè)基因、多種因素的相互作用,包括：生活方式、飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、炎性腸病、癌基因突變、抑癌基因失活等等。IARS2基因是編碼線粒體異亮氨酸-tRNA合成酶的核基因,有研究提示：編碼線粒體氨酰-tRNA合成酶的基因突變可導(dǎo)致疾病,但I(xiàn)ARS2基因與結(jié)腸癌的相關(guān)性研究目前國內(nèi)外暫未見報(bào)道。在我們的實(shí)驗(yàn)中,通過觀察病理確診的人結(jié)腸癌與癌旁組織中IARS2基因的表達(dá)差異、構(gòu)建IARS2-siRNA慢病毒載體并感染結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、檢測敲減IARS2基因后結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的生物學(xué)行為變化,初步探究IARS2基因與結(jié)腸癌的關(guān)系。研究目的：1、明確結(jié)腸癌組織與不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中IARS2基因的表達(dá)水平。2、從細(xì)胞水平探索敲減IARS2基因?qū)Y(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響。方法：1、對接受結(jié)腸癌手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的6例結(jié)腸癌患者的癌組織及健康結(jié)腸組織(距原發(fā)腫瘤10cm以上組織)進(jìn)行取材,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IARS2基因在人結(jié)腸癌與健康結(jié)腸組織的表達(dá)水平,用2-ΔΔct分析法比較IARS2基因在人結(jié)腸癌與健康結(jié)腸組織之間的表達(dá)差異。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IARS2基因在不同的結(jié)腸癌細(xì)胞株(RKO、 SW480、HCT116、DLD1、HT-29、SW620)中的表達(dá)水平,用2-ΔΔct分析法比較IARS2基因在不同結(jié)腸癌細(xì)胞之間的表達(dá)差異。2、設(shè)計(jì)IARS2-siRNA序列并制備含有IARS2-siRNA序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌,對長出的陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定及測序比對,驗(yàn)證擴(kuò)增出的重組質(zhì)粒中是否含有IARS2-siRNA序列。由于目前尚無IARS2蛋白的抗體,不能直接使用IARS2蛋白抗體進(jìn)行Westernblot檢測,故選用RNAi外源篩靶的方法驗(yàn)證靶點(diǎn)干擾的有效性。用含IARS2序列并帶有Flag標(biāo)記的質(zhì)粒與含IARS2-siRNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,對照組將RNAi質(zhì)粒換為含陰性對照序列的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,收集轉(zhuǎn)染后36-48小時(shí)的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞,分別提取蛋白后利用Flag抗體進(jìn)行Western Blot檢測,間接反映IARS2-siRNA序列能否降低細(xì)胞中IARS2基因在蛋白水平的表達(dá)。將含有IARS2-siRNA的重組質(zhì)粒與兩種輔助包裝原件質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并培養(yǎng)至48h以后,收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液并濃縮得到慢病毒濃縮液。將生長狀態(tài)良好的RKO細(xì)胞分為兩組：對照組(加入含陰性對照序列的慢病毒)和實(shí)驗(yàn)組(加入含IARS2-siRNA的慢病毒)進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。慢病毒感染細(xì)胞后3天在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況；慢病毒感染細(xì)胞后5天收集RKO細(xì)胞,以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測兩組細(xì)胞IARS2基因在mRNA水平的表達(dá)情況,用2-ΔΔct分析法比較IARS2基因mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的表達(dá)差異,觀察在mRNA水平IARS2基因的敲減效果。3、將慢病毒感染后的RKO細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),在相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行以下關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)：將處于對數(shù)生長期的兩組RKO細(xì)胞重懸成細(xì)胞懸液接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng),從鋪板后第二天開始,每天Cellomics檢測讀板一次,連續(xù)檢測讀板5天,觀察兩組細(xì)胞的增殖情況；當(dāng)兩組RKO細(xì)胞在6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上生長至覆蓋率約為80%時(shí)收集細(xì)胞,70%乙醇固定并經(jīng)PI染色,通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測,了解兩組細(xì)胞分別處于G0/G1期、S期、G2/M期的細(xì)胞百分率；當(dāng)兩組RKO細(xì)胞的細(xì)胞匯合度達(dá)85%時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-APC染色,通過流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞的凋亡情況,分別采用凋亡散點(diǎn)圖和凋亡峰型圖進(jìn)行分析；將處于對數(shù)生長期的兩組RKO細(xì)胞重懸成細(xì)胞懸液接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)7天,通過觀察細(xì)胞在培養(yǎng)板上的克隆形成能力并計(jì)數(shù)克隆數(shù)量,來比較兩組細(xì)胞的的成瘤能力。結(jié)果：1、6對人結(jié)腸癌組織和健康結(jié)腸組織(距原發(fā)腫瘤10cm以上組織)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果提示：腫瘤組織中IARS2基因mRNA的表達(dá)水平高于健康組織；用2-ΔΔCt分析法比較后顯示：結(jié)腸癌組織的IARS2基因mRNA的表達(dá)水平比健康結(jié)腸組織的表達(dá)水平平均增高近2倍,最高的超過3倍。不同結(jié)腸癌細(xì)胞的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果提示：在6個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株中都有IARS2基因的表達(dá)；用2-ΔΔct分析法比較后顯示：結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株IARS2基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸癌SW480、HCT116、DLD1、 HT-29、SW620細(xì)胞株。2、成功構(gòu)建含IARS2-siRNA的重組質(zhì)粒,陽性克隆經(jīng)PCR及測序證實(shí)IARS2-siRNA序列插入正確。Western blot檢測提示：經(jīng)轉(zhuǎn)染IARS2-siRNA質(zhì)粒后,細(xì)胞在IARS2蛋白水平明顯降低；證明實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的含IARS2-siRNA的慢病毒質(zhì)粒對IARS2基因的表達(dá)有敲減作用。將IARS2-siRNA慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝后感染結(jié)腸癌RKO細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組和對照組的感染效率都達(dá)到80%以上。經(jīng)IARS2-siRNA慢病毒感染后的RKO細(xì)胞,IARS2基因的mRNA表達(dá)水平明顯低于Control組；表明IARS2-siRN A慢病毒對IARS2基因在mRNA水平的表達(dá)有敲減作用。3、經(jīng)慢病毒感染后：IARS2-siRNA組RKO細(xì)胞生長及倍增速率都慢于Control組。提示：經(jīng)IARS2-siRNA慢病毒感染后,RKO細(xì)胞的生長減緩；IARS2基因可能促進(jìn)細(xì)胞增殖。IARS2-siRNA組RKO細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞較Control組增多,處于S期的細(xì)胞較Control組減少；提示：IARS2基因可能影響細(xì)胞的周期分布。IARS2-siRNA組RKO細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比明顯高于Control組；也即：IARS2-siRNA組發(fā)生凋亡的RKO細(xì)胞顯著增加；IARS2基因可能抑制細(xì)胞凋亡。IARS2-siRNA組RKO細(xì)胞的克隆數(shù)目較Control組明顯減少；提示IARS2可能促進(jìn)了細(xì)胞的成瘤能力。結(jié)論：1、IARS2基因在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于健康組織,但需進(jìn)一步增加樣本量,研究結(jié)腸癌患者不同臨床分期、病理組織類型與IARS2基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。2、RKO細(xì)胞作為工具細(xì)胞為IARS2基因研究奠定了基礎(chǔ)。3、IARS2基因促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞成瘤能力,抑制其細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

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