本文關(guān)鍵詞：木香烯內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯抑制膠質(zhì)瘤相關(guān)作用機(jī)制的研究　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:兩種倍半萜烯內(nèi)酯,木香烯內(nèi)酯(Costunolide,CT)和去氫木香內(nèi)酯(Dehydrocostus lactone,DHE),在過去被用作為抗炎藥來治療多種疾病。最近幾年,因研究發(fā)現(xiàn)他們對多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出良好的抗癌效果而引起廣泛關(guān)注。然而,它們能否對膠質(zhì)瘤產(chǎn)生作用及相關(guān)作用機(jī)制目前卻知之甚少。本課題旨在探討二者抗膠質(zhì)瘤的作用,以及潛在的作用機(jī)制。方法:為了評估CT和DHE抗膠質(zhì)瘤的作用效果,我們用不同濃度的CT和DHE(0,1,10,25,50和100μM)對三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U118,U251和U87)分別處理12,24,36和48小時。然后采用MTT實(shí)驗(yàn)去檢測細(xì)胞活力。接下來,我們應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)去檢驗(yàn)CT和DHE對U87和U251細(xì)胞克隆形成能力的影響。隨后,我們在無血清的情況下進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),來檢驗(yàn)CT和DHE對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移能力的影響。激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)被用來檢測經(jīng)DHE處理的U87細(xì)胞,是否會造成細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿中。然后,我們應(yīng)用western blot的方法進(jìn)一步檢測在DHE處理U87細(xì)胞的過程中,從線粒體釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C的量。為了更好的探討DHE誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,我們通過western blot的方法對線粒體介導(dǎo)的凋亡信號通路中的幾個凋亡相關(guān)蛋白予以檢測。后來,我們應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)方法,對三種人源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U118,U251和U87)中的COX-2蛋白表達(dá)情況予以檢測,來比較三者之間的相對表達(dá)量的高低。之后,我們以U87和U251細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,檢測DHE抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的作用是否與COX-2相關(guān)。然后,分別用western blot和RT-PCR的方法在蛋白和m RNA水平對COX-2的表達(dá)予以檢測。為了明確DHE對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的COX-2 m RNA的表達(dá)水平的抑制效應(yīng)是否是通過影響p300和p65/p50NF-κB與COX-2啟動子的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的,我們將經(jīng)DHE(未)處理過的U87細(xì)胞通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)實(shí)驗(yàn)予以檢測分析。為了進(jìn)一步明確DHE是否影響p300和p65/p50 NF-κB與COX-2啟動子的結(jié)合活性,我們采用鏈霉親和素-瓊脂糖pull down實(shí)驗(yàn)對其予以檢測。該實(shí)驗(yàn)的大致情況是,向經(jīng)DHE(未)處理過的U87細(xì)胞的核蛋白提取液中加入生物素化的COX-2啟動子區(qū)探針和鏈霉親和素-瓊脂糖小球。孵育后離心,然后,與COX-2結(jié)合的p300和p65/p50 NF-κB以復(fù)合體的形式被沉淀下來,隨后執(zhí)行western blot實(shí)驗(yàn)予以分析。其后,我們對經(jīng)DHE(未)處理過的U87細(xì)胞核蛋白提取液中總的p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量予以檢測分析。為了進(jìn)一步證實(shí)DHE抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位和它們之間的相互作用,我們采用免疫熒光染色,檢測p300和p65/p50 NF-κB在U87細(xì)胞中的定位和分布。為了充分明確DHE對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制,我們接下來調(diào)查DHE對U87和U251細(xì)胞中IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路的影響,采用western blot方法對p-IKKα/β、IKKα、IKKβ、p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白的表達(dá)水平予以檢測。此后,我們設(shè)想IKKβ可能是DHE作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們應(yīng)用分子對接實(shí)驗(yàn)來模擬DHE和IKKβ之間的相互作用。為了檢測DHE是否可以通過血腦屏障,我們給每只Sprague Dawley(SD)大鼠以100 mg/kg的劑量注射DHE。一小時后,我們采用立體定位的方式從大鼠的小腦延髓池抽取腦脊液(Cerebro-Spinal Fluid,CSF)。然后,利用乙腈對CSF中的DHE進(jìn)行萃取,隨后用質(zhì)譜進(jìn)行分析。然后,我們建立裸鼠種植瘤模型來進(jìn)一步檢驗(yàn)DHE在體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤的作用情況。為了監(jiān)測DHE的毒性,每兩天記錄裸鼠體重;為了監(jiān)測DHE的抑瘤效果,每隔一天記錄腫瘤的大小。所有裸鼠在種瘤30天后處死,隨后將腫瘤完整取出稱重,然后放入10%福爾馬林中固定。此外,為了進(jìn)一步探索DHE在體內(nèi)抑制腫瘤生長的潛在作用機(jī)制,我們應(yīng)用免疫組化實(shí)驗(yàn)對種植瘤中COX-2、p-p65和p-IKKβ的水平予以檢測。結(jié)果:將三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U118、U251和U87)細(xì)胞系用不同濃度的CT和DHE處理不同時間后,應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞活力予以檢測。我們發(fā)現(xiàn)CT和DHE都可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,且呈劑量和時間的依賴性。經(jīng)CT處理48小時后,CT對U118、U251和U87三種細(xì)胞作用的IC50值分別是25.24±1.15、34.45±2.8和40.18±3.21μM;而DHE對U118、U251和U87三種細(xì)胞作用的IC50值分別是17.16±2.11、22.33±1.93和26.42±2.84μM。然后,應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞克隆形成能力予以評估。我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CT和DHE均可以顯著抑制克隆形成的數(shù)量,并呈現(xiàn)劑量依賴性。再應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的遷移能力予以評估。我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CT和DHE可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移率。此后,應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測DHE是否可以引起U87細(xì)胞中的細(xì)胞色素C從線粒體中釋放。在對照組,細(xì)胞色素C主要存在于線粒體中,然而,隨著DHE濃度的增加,綠色熒光開始彌散,表明胞漿中細(xì)胞色素C水平逐漸升高。然后,我們對線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白予以檢測,發(fā)現(xiàn)DHE可以顯著增加胞漿中細(xì)胞色素C的蛋白水平,以及cleaved caspase3/9蛋白的水平,并且下調(diào)Bcl-2蛋白的水平和Bcl-2/BAX的比率。然后,我們應(yīng)用western blot方法對U118、U251和U87細(xì)胞中的COX-2蛋白表達(dá)水平予以檢測,結(jié)果表明,U87和U251細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)量明顯高于U118細(xì)胞。因此,我們選用U87和U251兩種細(xì)胞系去驗(yàn)證DHE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)是否與影響COX-2的表達(dá)相關(guān)。Western blot和RT-PCR的結(jié)果表明在蛋白和m RNA水平DHE都可以有效的抑制COX-2的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量依賴性。接下來,我們通過Ch IP實(shí)驗(yàn)和鏈霉親和素-瓊脂糖pull down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證,是否p300和p65/p50 NF-κB參與了DHE對COX-2的調(diào)節(jié)過程。結(jié)果表明,與對照組相比,DHE可以顯著抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB與COX-2啟動子的結(jié)合。隨后,western blot結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)DHE處理后,胞核中p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量顯著減少。然后,我們通過激光共聚焦免疫熒光染色來觀察U87細(xì)胞中p300和p65/p50 NF-κB的定位和分布情況。結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)DHE處理后,p300和p65/p50 NF-κB在胞核中的量明顯減少,而在胞漿中的量相對增多。因此,為了充分明確DHE對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制,我們接下來檢測DHE對U87和U251細(xì)胞中IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路的影響。Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)DHE處理后,p-IKKα/β、p-IκBα和p-p65蛋白的水平顯著下調(diào),且呈劑量依賴性。然而,IKKα、IKKβ、IκBα和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平基本不變。這說明DHE可能是通過抑制IKKβ的活性而抑制NF-κB的激活。然后,行分子對接實(shí)驗(yàn)表明,DHE可以與IKKβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)相互結(jié)合。這些結(jié)果表明,DHE是通過作用于IKKβ靶點(diǎn)來抑制NF-κB信號通路,從而抑制COX-2的表達(dá)的。在體內(nèi)研究中,將CSF樣本通過質(zhì)譜檢測分析發(fā)現(xiàn),在1.81 mins出現(xiàn)一個單峰。表明在大鼠模型中,DHE可以迅速通過血腦屏障。因此,我們建立裸鼠種植瘤模型進(jìn)一步探討DHE在體內(nèi)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的作用。在DHE處理過程中,裸鼠體重未發(fā)生明顯變化,然而,與對照組相比,處理組的腫瘤體積和重量均明顯減小。所以,這些結(jié)果表明,DHE在體內(nèi)模型中也能夠很好的發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。接下來,免疫組化結(jié)果表明DHE可以抑制IKKβ/NF-κB/COX-2通路的激活,這可能是DHE抑制種植瘤生長的機(jī)制之一。結(jié)論:本研究旨在探討CT和DHE抗膠質(zhì)瘤的特性及其潛在的作用機(jī)制。研究表明CT和DHE均可以顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞活力、增殖能力和遷移能力。同時,DHE還可以通過促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放,激活caspase信號級聯(lián),從而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外,本研究證實(shí)DHE可以通過靶向IKKβ激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn),抑制NF-κB信號通路的激活,從而抑制p300和NF-κB對COX-2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。另外,本研究首次證實(shí)DHE可以通過血腦屏障。而且,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,DHE可以抑制裸鼠種植瘤的生長,并且這種效應(yīng)可能部分是通過抑制IKKβ/NF-κB/COX-2通路的激活實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1323023