本文關(guān)鍵詞：3D打印骨科內(nèi)植物在兔膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)中的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:膝關(guān)節(jié)在運(yùn)動(dòng)或高速撞擊中易受到損傷,尤其以韌帶損傷、軟骨損傷及關(guān)節(jié)周圍骨折最為常見。若不開展有效治療,嚴(yán)重者將導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎、骨折畸形愈合及不愈合等并發(fā)癥。膝關(guān)節(jié)損傷的手術(shù)修復(fù)治療中,相關(guān)骨科內(nèi)植物的應(yīng)用對修復(fù)的效果至關(guān)重要。以前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament,ACL)撕裂為例,在重建ACL過程中,需采用界面螺釘植入骨隧道內(nèi)對移植物進(jìn)行固定,以保證移植物的穩(wěn)定性,促進(jìn)腱骨愈合,重塑ACL功能。術(shù)中常用的界面螺釘材料多為生物可吸收性高分子聚合物如聚乳酸(Polylactic acid,PLA)或聯(lián)合無機(jī)材料如羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)等。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)部分病例中PLA螺釘術(shù)后在骨隧道內(nèi)完全降解需要7至10年的時(shí)間。較低的降解速率使界面螺釘在骨隧道內(nèi)占位,影響隧道內(nèi)新生骨形成從而阻礙了腱骨愈合效果。而對于膝關(guān)節(jié)周圍骨折尤其是股骨遠(yuǎn)端粉碎性骨折及脛骨平臺(tái)骨折,多需要植入骨移植物進(jìn)行修復(fù)以進(jìn)行骨缺損治療,防治骨折畸形愈合或者骨不連。然而自體骨或異體骨移植以及人工合成的骨移植物因其各自并發(fā)癥限制其在臨床上廣泛應(yīng)用。可見膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的內(nèi)植物仍存在諸多缺陷,亟待改進(jìn)。近年來,三維打印(three-dimensional printing,3D printing)技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域蓬勃發(fā)展,主要是取決于其個(gè)性化定制、可操作性、可實(shí)現(xiàn)多種材料制造等諸多優(yōu)點(diǎn)。在外科手術(shù)中,3D打印技術(shù)目前主要以模型術(shù)前規(guī)劃,導(dǎo)板術(shù)中定位,假體術(shù)中植入的應(yīng)用最為廣泛。因此針對上述膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)中如ACL重建界面螺釘及膝關(guān)節(jié)周圍骨折骨移植物的不足,本課題組希望通過能借助3D打印技術(shù),尤其是最近廣泛普及的桌面3D打印機(jī),利用其成本低,易操作,應(yīng)用材料廣泛的特點(diǎn)來對以上兩種損傷修復(fù)的內(nèi)植物進(jìn)行改進(jìn),使其表現(xiàn)出更好的修復(fù)性能。在運(yùn)用臨床上常規(guī)材料PLA及HA根據(jù)ACL重建模型制造多孔的界面螺釘支架聯(lián)合負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)用于 ACL 重建修復(fù)的同時(shí)著眼于新型打印材料用于打印骨移植物支架的強(qiáng)度改進(jìn),使其可用于關(guān)節(jié)周圍骨折缺損填充修復(fù),主要內(nèi)容圍繞下述幾個(gè)方面展開:1、3D打印PLA界面螺釘支架制造及體外生物學(xué)特性;2、PLA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs重建兔ACL;3、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架的制備及理化特性;4、高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)周圍骨缺損。第一部分3D打印PLA界面螺釘支架制造及體外生物學(xué)特性目的通過3D打印機(jī)設(shè)計(jì)制備PLA界面螺釘支架,HA對其進(jìn)行表面修飾,并檢測螺釘支架負(fù)載細(xì)胞的生物學(xué)性能。方法·依據(jù)新西蘭大白兔前交叉韌帶重建模型設(shè)計(jì)PLA界面螺釘支架并通過3D打印機(jī)進(jìn)行制造。利用化學(xué)共沉淀方法合成HA粉體,X射線衍射(XRD)鑒定材料成分。通過層層靜電組裝法對PLA界面螺釘支架進(jìn)行表面修飾制得PLA/HA螺釘支架,運(yùn)用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察修飾前后支架的表面形態(tài),通過排水法測定螺釘支架的孔隙率。將兔BMSCs分別與PLA,PLA/HA螺釘支架共培養(yǎng)(PLA組,PLA/HA組),同時(shí)用Pluronic F-127凝膠負(fù)載BMSCs后與PLA-HA支架共培養(yǎng)(PLA/HA+PluronicF-127組)。通過SEM觀察三組細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測定三組細(xì)胞增殖情況,PCR檢測三組成骨指標(biāo)的表達(dá)情況。結(jié)果通過3D打印機(jī)制備PLA界面螺釘支架符合設(shè)計(jì)要求,支架內(nèi)空道均勻分布,相互連通的,孔徑約為290 ±16 μm,孔隙率為42 ±5%。合成HA晶體的直徑約200nm。經(jīng)表面修飾后HA在PLA/HA螺釘支架中均勻分布。相較于PLA組和PLA/HA組,PLA/HA+PluronicF-127組表現(xiàn)出良好的細(xì)胞形態(tài),最高的增殖性能及最佳的成骨分化性能。結(jié)論通過3D打印及表面修飾成功制備PLA/HA界面螺釘支架。利用Pluronic F-127凝膠負(fù)載細(xì)胞構(gòu)建PLA/HA螺釘支架BMSCs復(fù)合體,生物活性良好。為在ACL重建中,利用PLA/HA螺釘支架BMSCs復(fù)合體進(jìn)行ACL修復(fù)提供了可能。第二部分PLA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs重建兔ACL目的將Pluronic F-127凝膠負(fù)載BMSCs種植于PLA/HA螺釘支架上,觀察其用于兔ACL重建自體肌腱移固定后骨隧道骨量變化及腱骨界面愈合情況。方法將36只新西蘭雄性大白兔隨機(jī)平均分為三組,利用自體肌腱進(jìn)行雙側(cè)ACL重建,股骨側(cè)隧道中置入螺釘支架固定肌腱:PLA組,以單純PLA螺釘支架進(jìn)行固定;PLA/HA組,以單純PLA/HA螺釘支架進(jìn)行固定;BMSCs組,Pluronic F-127凝膠負(fù)載BMSCs種植于PLA/HA螺釘支架后進(jìn)行固定。術(shù)后4周,12周分別行MRI掃描,觀察骨隧道內(nèi)螺釘支架的情況;行Micro-CT掃描,分別測量各組股骨骨隧道的成骨情況;硬組織切片進(jìn)行組織學(xué)檢測,觀察各組股骨骨隧道內(nèi)腱骨愈合情況。結(jié)果MRI顯示各組螺釘支架沿軸向位于股骨隧道中,無斷釘及其他并發(fā)癥出現(xiàn)。術(shù)后4周、12周,BMSCs組股骨隧道內(nèi)感興趣區(qū)骨形成指標(biāo)(BV/TV,Tb.N,Tb.Th,Tb.Sp)均高于PLA及PLA/HA組,新生骨沿螺釘孔道在骨隧道內(nèi)均勻分布。尤其是在術(shù)后12周,BMSCs組新生骨相互連接形成一個(gè)類似螺釘支架的三維立體結(jié)構(gòu)。硬組織切片組織學(xué)顯示,相較于PLA及PLA/HA組,BMSCs組術(shù)后4周腱骨界面內(nèi)呈現(xiàn)出較多的軟骨樣細(xì)胞表現(xiàn),術(shù)后12周腱骨整合良好,有更好的細(xì)胞形態(tài)排列及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。結(jié)論P(yáng)LA/HA界面螺釘支架復(fù)合BMSCs用于兔ACL重建不僅起到自體肌腱固定作用,同時(shí)可對ACL重建進(jìn)行修復(fù),有效增加骨隧道內(nèi)新生骨量,形成穩(wěn)定的腱骨愈合界面。第三部分高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架的制備及理化特性目的 合成摻鎂硅酸鈣粉體(CSi-Mg),并運(yùn)用3D打印機(jī)制備全新高強(qiáng)度摻鎂硅酸鈣多孔支架,并對該支架的微觀結(jié)構(gòu),力學(xué)性能,體外生物降解性等進(jìn)行探究。方法化學(xué)沉淀法制備含鎂摩爾比例為10%的摻鎂硅酸鈣粉(CSi-Mg10),同時(shí)制備純硅酸鈣粉(CSi)及β-磷酸三鈣粉(β-TCP)作為對照。運(yùn)用XRD檢測材料成分。稱取上述三種材料各5.0 g分別與4.0 g 6%聚乙烯醇溶液均勻混合后制成三種生物陶瓷墨水,進(jìn)行擠出式3D打印,制得三種支架((?)6×6 mm)。60 ℃干燥過夜后1100 ℃ 一步燒結(jié)3小時(shí)。排水法計(jì)算支架孔隙率,SEM檢測支架微觀結(jié)構(gòu)。將支架置于模擬體液SBF中,于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測定三種支架的抗壓強(qiáng)度,彈性模量。將支架置于Tris-Hcl緩沖液中,通過檢測各時(shí)間點(diǎn)支架重量的損失及溶液中pH值,Ca,Si,Mg的濃度,評估材料降解過程中周圍環(huán)境的變化。結(jié)果三種生物陶瓷支架孔徑均約為350 μm,孔道相互連接,孔隙率均超過50%。CSi-Mg10支架初始抗壓強(qiáng)度顯著(～115 MPa),分別超過CSi的4倍(～26 MPa),TCP的10倍(～11MPa)。18周后,CSi-Mg10支架架(～36M0)相較于另外兩種(9 MPa)依然保持較高的抗壓強(qiáng)度。此外,相較于CSi過快降解的劣勢,CSi-Mg10支架體外降解速率相對偏慢,隨時(shí)間推移逐漸適量釋放出Ca,Si及Mg成骨活性成分。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)通過3D打印成功制備全新高強(qiáng)度摻鎂硅酸鈣多孔支架,表現(xiàn)出更佳的體外力學(xué)強(qiáng)度變化及生物降解特性,為骨缺損修復(fù)尤其是負(fù)重區(qū)骨修復(fù)材料領(lǐng)域提供了 一個(gè)新方向。第四部分高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)周圍骨缺損目的利用3D打印摻鎂硅酸鈣多孔支架與成骨細(xì)胞共培養(yǎng),探究支架對體外細(xì)胞增殖和成骨分化的作用。通過股骨髁缺損模型植入支架進(jìn)行兔膝關(guān)節(jié)周圍骨缺損修復(fù),探究支架的成骨能力,降解特性及體內(nèi)力學(xué)變化。方法將MC3T3細(xì)胞系分別與3D打印β-TCP,CSi和CSi-Mg10多孔支架共培養(yǎng)后使用SEM及細(xì)胞骨架染色觀察細(xì)胞形態(tài);使用CCK-8檢測細(xì)胞增殖性能及PCR評估支架的成骨性能。在兔膝關(guān)節(jié)周圍骨缺損修復(fù)中,36只大白兔隨機(jī)平均分為三組(β-TCP組,CSi組,CSi-Mg10組),進(jìn)行雙側(cè)股骨髁骨缺損修復(fù)。術(shù)后6周,12周,18周分別行行Micro-CT掃描,分析支架成骨能力;行硬組織切片進(jìn)行組織學(xué)檢測,熒光雙標(biāo)計(jì)算鈣沉積速度(MAP),觀察新生骨,支架降解情況;使用能譜掃描(EDS)檢測磷灰石相的轉(zhuǎn)化過程;于對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測定體內(nèi)支架的抗壓強(qiáng)度。結(jié)果體外生物學(xué)檢測中,CSi-Mg10組相較于CSi組細(xì)胞形態(tài)及成骨能力均無顯著性差異(p0.05),均顯著高于β-TCP組(p0.05)。在膝關(guān)節(jié)周圍骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,CSi-Mg10組新生骨加速生長,在術(shù)后18周與CSi組新生骨量無顯著性差異,同時(shí)仍保持著與缺損區(qū)骨相符的抗壓強(qiáng)度(10-15MPa)和彈塑性力學(xué)反應(yīng)。然而,β-TCP組成骨顯著遲緩且β-TCP組與CSi組力學(xué)強(qiáng)度較低(10 MPa)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功應(yīng)用高強(qiáng)度3D打印摻鎂硅酸鈣多孔支架進(jìn)行兔關(guān)節(jié)周圍骨缺損修復(fù),該支架在有效增加新生骨量的同時(shí),依然保持了良好的力學(xué)性能,或可成為一種具有潛力的臨床骨修復(fù)植入材料。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R687.4

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本文編號(hào)：1322502