發(fā)布時間：2017-12-23 05:02

  本文關鍵詞：2型腓骨肌萎縮癥家系新致病基因的篩查及發(fā)病機制研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 腓骨肌萎縮癥 CMT2 AFAP-120 轉(zhuǎn)基因小鼠 微絲骨架

【摘要】：腓骨肌萎縮癥又稱為CMT,是最常見的遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,發(fā)病率約為1/2500。CMT在幼年及成年都可發(fā)病,患者常伴有四肢無力、四肢遠端肌肉進行性萎縮、足部骨骼畸形、輕度感覺受累等癥狀。CMT通常不致命,但由于患者運動功能受損,生活質(zhì)量受到嚴重影響。根據(jù)患者的病理特點及運動神經(jīng)元傳導速率,CMT可分為脫髓鞘型(CMT1,MNCV38 m/s)、軸索型(CMT2,MNCV38 m/s)和中間型(ICMT,25MNCV45 m/s)三種類型。CMT具有明顯的遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性特點。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)80多個基因的突變與CMT的發(fā)生相關,其中超過半數(shù)的致病基因都是在2009年外顯子組測序技術被應用后發(fā)現(xiàn)的。至今,超過90%的CMT1患者通過基因診查明了致病基因,然而CMT2患者中卻仍有25-43%沒有得到明確的基因診斷,即使在最新的臨床病例中,也仍有很多CMT2患者未能檢出致病基因。篩查CMT2新的致病基因,不僅有助于提高CMT2患者的檢出率,還有助于CMT2發(fā)病機制地闡明,幫助CMT2患者采取更準確、有效的治療措施。前期,我們實驗室在山東省發(fā)現(xiàn)了一個遺傳病家系,該家系連續(xù)三代均有發(fā)病患者。遺傳系譜圖分析,該家系疾病為常染色體顯性遺傳病。我們對該家系部分發(fā)病患者進行了全面的臨床檢查,檢查發(fā)現(xiàn)該家系患者四肢遠端肌肉萎縮,出現(xiàn)諸如爪形手、鶴形腿、高弓足、槌狀趾等CMT病癥。電生理檢查發(fā)現(xiàn),患者正中神經(jīng)和尺神經(jīng)的運動神經(jīng)元傳導速率輕度減慢(36-47 m/s),而各神經(jīng)的復合動作電位明顯降低;患者腓腸神經(jīng)病理檢查發(fā)現(xiàn),有髓神經(jīng)纖維軸索發(fā)生明顯萎縮,出現(xiàn)空泡樣病變,少數(shù)髓鞘出現(xiàn)分層結(jié)構(gòu)。經(jīng)臨床診斷,該家系患者被確診為CMT2型。為明確該CMT2家系的發(fā)病原因,我們對該家系患者進行了CMT2常見致病基因的篩查,未發(fā)現(xiàn)常見致病基因發(fā)生突變。為尋找該家系遺傳病的致病基因,我們利用外顯子組捕獲與二代測序技術,對患者基因組進行了突變篩查,篩查獲得77個突變基因,共82個突變位點。然后,我們對山東CMT2家系成員基因組內(nèi)的這些位點一一進行了Sanger測序驗證,并進行了基因型與表型共分離分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者基因組中AFAP-120基因的第1621位發(fā)生錯義突變(c.1621CT),其編碼蛋白第541位非極性脯氨酸被極性絲氨酸替代。在正常人群中對AFAP-120基因突變進行篩查,未發(fā)現(xiàn)相關突變。為檢測AFAP-120c.1621CT突變是否具有廣泛的普適性,在其他CMT2患者中也同樣存在,我們先后收集了148例CMT2患者基因組樣品,這些樣品均未發(fā)現(xiàn)常見CMT2致病基因的突變。對這些患者AFAP-120基因所有的外顯子進行測序分析,遺憾的是并未發(fā)現(xiàn)c.1621CT突變,但篩查到一個c.1738AG(p.N580D)SNP位點。人AFAP-120基因定位于4p16.1,其編碼蛋白是一個由814個氨基酸構(gòu)成的微絲結(jié)合蛋白。AFAP-120蛋白是AFAP-110的剪接異構(gòu)體,在結(jié)構(gòu)上僅比AFAP-110多一個富含脯氨酸的NINS結(jié)構(gòu)域。我們在CMT2患者中篩查獲得的點突變P541S即位于NINS結(jié)構(gòu)域內(nèi)。AFAP-110在組織中廣泛表達,而AFAP-120僅在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達。至今,沒有關于AFAP-120突變導致CMT2發(fā)生的文獻報道,對AFAP-120功能,尤其是NINS片段的功能也知之甚少。序列比對分析,人AFAP-120第541位脯氨酸在各物種中高度保守,提示該位點氨基酸在進化中可能發(fā)揮不可替代的功能。利用MutationTaster、PolyPhen-2等軟件對AFAP-120 c.1621CT(p.P541S)突變位點的致病性進行分析,結(jié)果顯示該位點突變具有很強的致病性(PolyPhen-2 HumVar model預測得分高達0.996)。為進一步明確AFAP-120錯義突變c.1621CT(p.P541S)與CMT2發(fā)生之間的因果關系,并探索該突變導致CMT2發(fā)生的具體機制,我們構(gòu)建了AFAP-120P542S轉(zhuǎn)基因小鼠模型,將小鼠AFAP-120蛋白對應于患者AFAP-120突變位點的脯氨酸替換為絲氨酸。通過后續(xù)繁育與基因型鑒定,成功獲得點突變雜合及純合小鼠,并將雜合小鼠交配,繁殖獲得了不同基因型的同窩小鼠,用于后續(xù)行為學及神經(jīng)病理學實驗。對轉(zhuǎn)基因小鼠進行滾軸、熱板、足跡等行為學評價,發(fā)現(xiàn)出生11個月后,雌性純合AFAP-120 P542S小鼠四肢感覺能力較野生型小鼠減弱;雄性純合AFAP-120 P542S小鼠出現(xiàn)步態(tài)失調(diào)。對小鼠外周神經(jīng)進行了病理學實驗,發(fā)現(xiàn)AFAP-120發(fā)生突變后,部分雜合及純合小鼠,其腓淺神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維的軸索萎縮,出現(xiàn)大量空泡樣結(jié)構(gòu),平均橫切面積約減少30%;少數(shù)軸突伴有髓鞘病變,出現(xiàn)低片層結(jié)構(gòu)。部分雜合及純合小鼠,其腓淺神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維畸形,髓鞘增生,增厚或形成多個獨立而聚集的“龍卷風狀”結(jié)構(gòu),平均厚度分別增加約0.080μm、0.167μm;有髓神經(jīng)纖維軸索不規(guī)則萎縮,平均橫切面積分別減少0.520μm2、4.429μm2;無髓神經(jīng)纖維軸索萎縮,甚至消失;軸索中部分線粒體膨大,嵴消失,出現(xiàn)空泡狀改變。為探索AFAP-120 c.1621CT(p.P541S)導致CMT2發(fā)生的機制,研究AFAP-120及NINS結(jié)構(gòu)域的功能,我們在分子和細胞水平進行了實驗。利用免疫共沉淀的方法外源檢測了AFAP-120與其結(jié)合蛋白相互作用的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFAP-120(P541S)結(jié)合β-actin蛋白的量增加,約為AFAP-120(WT)的1.5倍;利用免疫熒光實驗檢測了AFAP-120(P541S)對細胞微絲骨架的影響,結(jié)果顯示在SH-SY5Y細胞內(nèi)AFAP-120(P541S)突變蛋白與微絲纏繞形成斑點狀結(jié)構(gòu)。微絲是細胞骨架的重要組成,微絲骨架重塑不僅影響神經(jīng)元及雪旺氏細胞的形態(tài),而且通過調(diào)節(jié)髓鞘蛋白的表達影響髓鞘的形成。作為一個微絲結(jié)合蛋白,AFAP-120突變后可能通過改變微絲骨架的結(jié)構(gòu)導致CMT2的發(fā)生�？偨Y(jié),我們發(fā)現(xiàn)了一個新的CMT2亞型及其致病基因AFAP-120 c.1621CT(p.P541S);構(gòu)建了AFAP-120P542S轉(zhuǎn)基因小鼠模型,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠軸索發(fā)生了與CMT2患者相同的病變;對AFAP-120(P541S)突變導致CMT2的分子機制進行了探索,發(fā)現(xiàn)AFAP-120蛋白NINS結(jié)構(gòu)域發(fā)生P541S點突變后,結(jié)合的微絲蛋白增多,微絲骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本文研究不僅為山東CMT2家系潛在患者的提前診斷、及時診治以及該家系成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù),而且為相關CMT2患者的基因診斷提供了參考。此外,本文對CMT2新治療藥物的開發(fā)以及AFAP-120蛋白功能的研究也有借鑒意義。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R746.4

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