本文關鍵詞：PLAC8在EV71感染致病中的作用機制研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腸道病毒71型(EV71)是嬰幼兒重癥手足口病的主要病原體之一,可導致腦干腦炎、肺水腫等組織病變,嚴重威脅嬰幼兒的健康成長。EV71感染死亡病例的腦干、脊髓、肺間質(zhì)中均可觀察到中性粒細胞的浸潤,說明EV71感染導致的組織炎癥反應損傷在EV71感染致病中起重要作用。然而,EV71感染導致一系列炎性反應以及為什么只在嬰幼兒階段感染致病的分子機制尚不清楚。為了揭示EV71在嬰兒體內(nèi)感染致炎性病變的機制,本研究利用EV71感染小鼠腦組織基因芯片篩選可能在組織炎性損傷中發(fā)揮作用的靶標蛋白。首先我們通過腹腔注射EV71病毒到1日齡昆明乳鼠,建立EV71感染小鼠模型。分別在感染三天及六天時,采取感染組及對照組小鼠腦組織,提取RNA,進行Affymetrix基因芯片檢測,篩選差異表達基因。通過KEGG聚類分析及差異基因功能分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達基因大都與抗病毒免疫相關。而其中,在感染三天及六天均上調(diào)表達的PLAC8基因目前的功能報道大都集中于促進細胞生長、癌癥進程方面。然而在HBV感染清除以及感染導致系統(tǒng)性炎癥患者體內(nèi)均檢測到了PLAC8基因的差異表達。以上報道及結(jié)果均表明,PLAC8很可能在抗病毒免疫中發(fā)揮了重要的作用。因此,本研究以PLAC8為對象,研究其在EV71感染中可能發(fā)揮的功能。EV71主要感染5歲以下的嬰幼兒,而重病患者大都在三歲以下。用EV71分別感染1日齡、2日齡、3日齡昆明小鼠,發(fā)現(xiàn)1日齡小鼠感染后相繼出現(xiàn)消瘦、四肢無力、癱瘓等明顯病變,感染七天后全部死亡。2日齡小鼠較1日齡小鼠的病變率和死亡率顯著降低,感染第七天死亡率為20%。而3日齡小鼠基本無明顯病變及死亡。說明EV71在小鼠中的感染也與年齡相關,乳鼠更易感。因此,可以利用EV71感染小鼠模型研究EV71感染與年齡的關系。為了研究PLAC8是否與EV71感染的年齡依賴性相關,對不同年齡小鼠肺組織中PLAC8的mRNA和蛋白表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)PLAC8的mRNA和蛋白表達均隨年齡增加而顯著下調(diào)。同時我們收集了小于3歲年齡組、3-12歲年齡組和12-18歲年齡組健康人外周血,每組各12-20人,提取全血RNA后,Real-time檢測外周血白細胞中PLAC8基因的mRNA表達。發(fā)現(xiàn)在人體中,PLAC8的表達量也隨年齡增長而顯著下調(diào)。說明PLAC8很有可能與EV71在嬰幼兒中更易感相關。隨后,在肺癌細胞A549中過表達PLAC8,發(fā)現(xiàn)PLAC8的過表達顯著促進EV71的增殖。并且在感染早期,6小時的時候,PLAC8過表達細胞中可顯著檢測到EV71結(jié)構(gòu)蛋白VP1的表達,而此時對照組細胞中檢測不到VP1蛋白的表達。說明PLAC8在EV71感染的早期即可促進病毒的增殖。分析其可能的原因有:PLAC8促進病毒受體SCARB2或PSGL-1的表達,使進入細胞的病毒數(shù)增加;PLAC8調(diào)控EV71病毒5’UTR活性,促進病毒翻譯;PLAC8抑制宿主細胞的抗病毒免疫,促進病毒增殖。因此,我們首先檢測了PLAC8對EV71病毒受體SCARB2和PSGL-1表達的影響,發(fā)現(xiàn)PLAC8的過表達并未引起EV71受體表達量的增加。然后將病毒的5’UTR插入到熒光素酶基因的調(diào)控區(qū),發(fā)現(xiàn)PLAC8未顯著引起熒光素酶的表達,說明PLAC8并不是通過調(diào)控EV71病毒5’UTR的活性而促進病毒基因的復制和翻譯。隨后對dsRNA的模式識別受體TLR3進行檢測,發(fā)現(xiàn)PLAC8的過表達顯著抑制TLR3及其下游干擾素調(diào)控基因IRF3的表達。說明PLAC8在感染早期對病毒增殖的促進是因為PLAC8抑制了宿主的抗病毒免疫應答,為病毒的增殖提供了良好的宿主環(huán)境,從而加速病毒的增殖。由于EV71感染產(chǎn)生的病變主要是腦、肺等組織的炎性損傷,因此檢測了PLAC8過表達對THP-1細胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6能力的影響。發(fā)現(xiàn)PLAC8可以顯著促進IL-6的表達。由于輔助性T淋巴細胞(T helper cells)的分化平衡在嬰幼兒免疫及抗病毒、炎性反應失衡中發(fā)揮了重要作用,因此我們通過淺表顳靜脈注射PLAC8表達質(zhì)粒,構(gòu)建PLAC8過表達小鼠模型,探討EV71感染后對Th細胞分化誘導因子表達的影響。發(fā)現(xiàn)在PLAC8過表達小鼠中,EV71感染后,與對照組相比,細胞因子IFN-γ的表達顯著下調(diào),IL-6、IL-4、IL-17A和TGF-β的表達顯著上調(diào)。而IFN-γ是Th1細胞分化的誘導因子,IL-6和IL-17A是Th17細胞分化誘導因子,而IL-4和TGF-β分別是Th2和Treg細胞分化誘導因子。因此,PLAC8的過表達,抑制Th1細胞分化,抑制其介導的抗病毒細胞免疫;促進Th2、Th17和Treg細胞分化,從而促進其介導的炎癥反應和免疫抑制作用。同時,PLAC8過表達小鼠外周血和肺組織中干擾素IFN-γ的下調(diào)和炎癥因子IL-6的上調(diào)也證明了PLAC8的過表達抑制了抗病毒免疫應答并促進了炎癥反應的增強。EV71感染PLAC8過表達小鼠后,對小鼠的腦、肺組織進行切片、HE染色觀察病理變化。與對照小鼠相比,PLAC8過表達小鼠肺泡壁增厚、局部肺泡結(jié)構(gòu)消失以及淋巴細胞浸潤現(xiàn)象更明顯;而腦組織神經(jīng)元細胞數(shù)量減少、細胞核固縮的現(xiàn)象也更明顯。證明過表達PLAC8后,EV71更易感染小鼠產(chǎn)生病變。綜上所述,利用EV71感染小鼠腦組織基因芯片篩選出可能在抗病毒免疫中發(fā)揮作用的PLAC8蛋白。分子生物學實驗表明,PLAC8通過抑制模式識別受體TLR3及其下游干擾素調(diào)控基因IRF3的表達,抑制抗病毒免疫應答,為病毒復制提供良好的宿主環(huán)境,從而促進病毒增殖。同時PLAC8可以促進炎癥因子IL-6的表達。動物學實驗表明,PLAC8調(diào)控Th細胞分化誘導因子的表達,抑制IFN-γ的表達,促進IL-6、IL-4、IL-17A和TGF-β的表達,使Th細胞分化由Th1向Th2、Th17和Treg偏移,導致細胞抗病毒免疫和炎癥反應應答失衡。由于PLAC8的表達隨年齡增長下調(diào),即在乳鼠中高表達,所以更易感染EV71病毒產(chǎn)生炎性病變。以上研究結(jié)果為揭示EV71在嬰幼兒中更易感致病的原因提供了重要線索。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 王曉雪;歐維琳;;EV71病毒感染與全身性炎癥反應綜合征的關系研究進展[J];華夏醫(yī)學;2015年03期

2 白敏;韓宜姚;;EV71感染手足口病患兒Th細胞免疫變化及其意義[J];中國現(xiàn)代醫(yī)生;2012年32期

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本文編號：1322358