本文關鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細胞對肝損傷的治療作用及其機制研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肝臟是人體內(nèi)最重要和最復雜的器官之一。藥物、飲酒、病毒等多種因素均可造成肝損傷,由此引發(fā)的肝炎、脂肪肝、肝硬化等在我國為常見肝臟疾病。肝損傷進一步發(fā)展形成的不可逆的肝衰竭是肝損傷患者死亡率較高的原因之一,而常規(guī)保肝治療效果大多不理想。干細胞是一群具有自我更新和多向分化潛能的細胞。根據(jù)其來源的不同,分為胚胎干細胞和成體干細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells;UCMSCs)是存在于臍帶血管周圍組織華爾通膠中的一種來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細胞,相對于其它來源如骨髓、臍帶血、脂肪等的MSCs,UCMSCs具有采集方便、來源豐富、分化潛能大、增殖能力強、低排斥免疫原性等顯著的優(yōu)點,可避免患者自體干細胞獲取時的痛苦及自體來源數(shù)量的限制。它們具有獨特的免疫調(diào)節(jié)作用、自我更新和跨胚層多向分化潛能等特點,正逐漸成為干細胞治療的理想種子細胞。干細胞移植治療作為原位肝移植治療的有利補充和替代,為各種終末期肝病的治療提供了新的思路和手段。在動物實驗和臨床研究中均發(fā)現(xiàn),MSCs對肝纖維化、急性肝衰竭、藥物性肝損傷有較好的治療作用。然而,其發(fā)揮作用的機制尚未完全闡明。同時,干細胞最佳的移植方式和細胞治療方案也未明確,臨床長期療效及安全性仍需進一步確證。這些均是制約干細胞廣泛應用的因素。目前認為MSCs可能通過多種途徑來發(fā)揮作用,主要有兩種假設:(1)替補作用,定向分化為肝細胞發(fā)揮替代作用;(2)免疫調(diào)節(jié)作用,刺激原有肝細胞的再生和修復。兩者可能相輔相成,共同發(fā)揮著治療作用。免疫調(diào)節(jié)作用是干細胞所固有的特性,而干細胞的定向分化所受影響因素眾多,如果找到影響干細胞定向分化的關鍵因素,給予適當?shù)母深A,將對干細胞的臨床應用提供很大的幫助。為了更好地研究干細胞的定向分化,國內(nèi)外研究者建立了不同的體外誘導方法,一般是通過不同濃度的各種細胞因子的誘導,誘導時間均在8-10周,存在誘導時間長,誘導效率低的弊端。已有研究表明干細胞周圍的細胞及體液形成的微環(huán)境在干細胞的增殖和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。當微環(huán)境發(fā)生變化時,干細胞可被激活,增殖或分化為不同類型的功能細胞。干細胞的分化涉及到各種受體的表達及其下游信號分子通路(如ERK、Wnt、Notch、MAPK、m TOR、JAK信號通路)的改變,不同的分化方向由不同的信號通路啟動。研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs可經(jīng)體外誘導分化為各種組織細胞,而與肝細胞發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄因子和肝祖/干細胞標志物在UCMSCs中高表達,提示UCMSCs在向肝細胞分化方面可能更具有優(yōu)勢。另有研究報道,肝富集轉(zhuǎn)錄因子之一肝細胞核因子-4α(Hepatocyte Nuclear Factor-4α;HNF-4α)在胚胎發(fā)育肝細胞形成的過程中發(fā)揮重要作用。前人研究結果提示HNF-4α有可能在UCMSCs向肝細胞定向分化中發(fā)揮重要作用。有研究報道,HNF-4α是AMPK作用的一個新的靶點基因,進一步研究它們在UCMSCs向肝細胞定向分化中的關系,有助于闡明UCMSCs向肝細胞定向分化的分子機制。第一部分臍帶間充質(zhì)干細胞對肝損傷的治療作用及體內(nèi)定向分化研究目的:建立急性肝損傷和肝纖維化大鼠模型,觀察并評價UCMSCs對兩種肝損傷模型大鼠的治療效果,研究靜脈移植的UCMSCs在體內(nèi)的行蹤以及定居在肝組織內(nèi)的干細胞的分化情況。方法:1無菌條件下,收集足月胎兒臍帶,采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代細胞。采用流式細胞術對UCMSCs免疫表型進行鑒定,對UCMSC體外分化潛能鑒定。應用熒光染料PKH26對干細胞進行熒光標記。通過腹腔單次注射50%CCl4制備急性肝損傷大鼠模型;采用TAA灌胃法制備肝纖維化大鼠模型。2實驗分組1)急性肝損傷實驗分組大鼠90只隨機分為5組:正常對照組、模型組、溶劑對照組(通過尾靜脈向模型大鼠注射500μL的生理鹽水)、治療組(通過尾靜脈向模型大鼠注射濃度為2×106個/m L的干細胞懸液500μL)和治療對照組(通過尾靜脈向正常大鼠注射濃度為2×106個/m L干細胞懸液500μL)。每組分為3 h、2 d、7d三個時間點,每個時間點6只大鼠,分別在治療后計劃時間點處死大鼠,收集標本。2)肝纖維化實驗分組大鼠120只隨機分為5組:正常對照組、溶劑對照組、單次治療組、多次治療組和治療對照組。單次治療組治療方法為成模后間隔1 w通過鼠尾靜脈移植UCMSCs 1×106個后,分別在移植后3 h、2 w、4 w處死大鼠,收集標本;多次治療組治療方法為在成模后間隔1 w通過鼠尾靜脈移植UCMSCs每周1次,連續(xù)4 w,每次移植量為1×106個,分別于最后一次治療后1 w和1 y處死大鼠,收集標本。正常對照組未作任何處理,溶劑對照組注射相同體積的生理鹽水,治療對照組通過尾靜脈注射1×106個干細胞懸液。各組在與治療組相同的時間點處死6只大鼠,收集標本。3指標評價通過肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦組織冰凍切片中的熒光觀察,跟蹤UCMSCs移植后在大鼠體內(nèi)的遷移。通過ALT、AST、MDA、TBIL的血清水平評價UCMSCs移植對急性肝損傷模型大鼠肝功能的影響,通過血清中BAM、TBIL、AKP、ALB、GLB的濃度評價UCMSCs移植對肝纖維化模型大鼠肝功能的影響。通過HE染色和Masson染色觀察UCMSCs移植對肝臟組織病理結構的影響。采用免疫組織化學法觀察UCMSCs在大鼠肝臟的定向分化。結果:1 UCMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定本實驗室已成功從臍帶原代培養(yǎng)出UCMSCs,經(jīng)過10次傳代細胞的形態(tài)和增殖能力無明顯改變,經(jīng)過細胞標志物表型鑒定高表達間充質(zhì)細胞標志,不表達或低表達造血細胞、內(nèi)皮細胞標志和主要組織相容性抗原,具有成骨和成脂的分化潛能。2熒光標記對干細胞的影響倒置顯微鏡下觀察,UCMSCs經(jīng)PKH26染色后,細胞形態(tài)與未標記的細胞相似,呈長梭形,漩渦狀排列生長。在熒光顯微鏡下呈紅色,標記率約為100%。從第3代UCMSC經(jīng)PKH26染色后,經(jīng)過5次傳代,每代5天,細胞的熒光強度逐漸減弱,到第4次傳代時,仍可檢測到熒光。MTT結果顯示兩組細胞各時間點的活性無顯著性差異(P0.05),說明熒光染色對細胞增殖無影響。3移植后UCMSCs在肝損傷大鼠體內(nèi)主要臟器的分布治療組肝臟組織中每個視野均可見PKH26標記的大量帶紅色熒光的UCMSCs,治療對照組大鼠肝臟組織中亦可見熒光標記的UCMSCs,但數(shù)量遠少于治療組(P0.05)。治療組脾臟和肺臟中亦可見熒光細胞(P0.05),與治療對照組脾臟和肺臟中的熒光細胞數(shù)量相比顯著降低(P0.05);兩組心臟、腎臟和腦組織中均偶見熒光細胞。4移植后UCMSCs在肝臟的分布熒光顯微鏡下可見:大鼠的肝臟組織中有大量帶紅色熒光的細胞,即PKH26標記的UCMSCs,每個視野均可見,UMSCs主要分布在肝臟組織的匯管區(qū)及血管周圍;每張切片隨機選擇3個不重復不重疊的視野照相并分析,與急性肝損傷組相比,正常對照組肝臟組織中熒光標記的UCMSCs數(shù)量顯著降低(P0.05)。與PKH26標記陽性細胞數(shù)量相比,吞噬細胞標志物EMR1陽性細胞數(shù)量顯著降低(P0.05),結果顯示86.32%-99.76%的PKH26標記陽性細胞未顯示EMR1陽性,說明這些細胞未被吞噬細胞所吞噬。5移植UCMSCs后對大鼠肝功能的影響1)移植UCMSCs后對急性肝損傷大鼠肝功能的影響與正常對照組相比,模型組大鼠血清24 h AST、ALT、MDA和TBIL水平顯著升高(P0.01),提示造模成功。移植干細胞3 h、2d和7d后,與正常對照組相比,模型組和溶劑對照組大鼠各時間點血清AST、ALT、MDA和TBIL顯著升高(P0.05或P0.01);與溶劑對照組相比,治療組各時間點AST、ALT、MDA和TBIL水平顯著降低(P0.05);與正常對照組相比,治療2d組MDA和TBIL水平無顯著性差異(P0.05),治療7d組AST和ALT水平無顯著性差異(P0.05)。2)移植UCMSCs后對肝纖維化大鼠體重和肝功能的影響在肝纖維化造模的過程中,與對照組相比模型組大鼠體重增長緩慢。UCMSCs治療后,與正常對照組相比,模型組和治療組大鼠體重均顯著下降(P0.05),與模型組相比,4w與4t組大鼠體重均顯著增加(P0.05)。與正常對照組相比,溶劑對照3h、2w、4w和4t組BAM、TBIL和AKP的血清濃度顯著增高,ALB/GLB顯著降低,溶劑對照1y組BAM顯著升高(P0.05)。與溶劑對照組相比,治療3h、2w、4w、4t、1y組BAM水平顯著降低(P0.05),治療2w、4w、4t組TBIL、AKP水平顯著降低,治療3h、2w、4w、4t、1y組ALB/GLB水平顯著升高(P0.05)。1)移植UCMSCs對急性肝損傷模型大鼠肝臟病理結構的影響大鼠肝臟切片HE染色可見,對照組肝組織內(nèi)可見呈放射狀排列整齊的肝小葉結構,肝細胞形態(tài)完整;模型組肝臟組織可見大量炎細胞浸潤,肝細胞變性、壞死嚴重。移植UCMSCs后,3h、2d和7d各組與模型組相比,平均每個視野炎細胞數(shù)量均顯著下降(P0.05),2d和7d各組與模型組相比,平均每個視野壞死細胞數(shù)量均顯著下降(P0.05)。2)UCMSCs治療對肝纖維化大鼠肝臟病理結構的影響大鼠肝臟切片HE染色可見模型組大鼠肝臟切片可見大量增生的纖維組織,穿插并分割肝小葉形成假小葉,其中可見大量炎細胞和增生的膽管細胞。Masson染色可見,纖維組織被染成深藍色,UCMSCs移植后,深藍色纖維組織明顯減少,治療時間越長,纖維組織越少見,模型組大鼠1年后肝臟組織內(nèi)可見膽管細胞重度增生,而治療組大鼠肝臟組織結構接近正常。染色結果分析顯示,與溶劑對照組相比,治療2 w、4 w、4 t和1 y組肝臟纖維化程度均顯著減輕,且治療4 t和1 y組纖維化程度輕于治療3 h、2w和4 w組(P0.05)。7 UCMSCs移植后在肝組織中定向分化為肝細胞1)UCMSCs移植后在CCl4所致肝損傷肝組織中定向分化為肝細胞肝臟切片免疫組織化學結果顯示,UCMSCs移植后3 h,可檢測到少量肝細胞特異標志物表達,但是未見到陽性肝細胞;UCMSCs移植后2d和7d,可見到陽性肝細胞,表達肝細胞標志物AFP、CK18,肝細胞功能蛋白ALB、TPH2。與正常對照組相比,各治療組肝細胞標志物表達量顯著升高(P0.05);與3h組相比,2d組與7d組AFP、ALB和TPH2的表達量顯著升高(P0.05);與2d組相比,7d組CK18、AFP、ALB和TPH2的表達量顯著升高(P0.05)。2)UCMSCs移植后在TAA所致肝纖維化肝組織中定向分化為肝細胞肝臟切片免疫組織化學結果顯示,UCMSCs移植后3 h,可檢測到少量肝細胞特異標志物表達,但是未見到陽性肝細胞;UCMSCs移植后2 w以后,可見到陽性肝細胞,表達肝細胞標志物CK18,肝細胞功能蛋白ALB、CYP3A4。與正常對照組相比,各治療組肝細胞標志物表達量顯著升高(P0.05);與3h組相比,2w、4w、4t與1y組ALB,CK18和CYP3A4的表達量顯著升高(P0.05);與2w組相比,4w、4t與1y6移植UCMSCs對肝損傷模型大鼠肝臟病理結構的影響組ALB和CYP3A4的表達量顯著升高(P0.05),與4w組相比,4t與1y組ALB和CYP3A4的表達量顯著升高(P0.05),與4t組相比,1y組CK18、ALB和CYP3A4的表達量顯著升高(P0.05)。結論:1移植UCMSCs可以改善急性肝損傷和肝纖維化模型大鼠的肝功能,并減輕急性肝損傷和肝纖維化模型大鼠肝臟組織病變。2經(jīng)靜脈移植的UCMSCs可以遷移并定居在受損肝臟組織;并且在肝臟組織定向分化為具有肝細胞特異標志物和功能蛋白的肝細胞,這可能是UCMSCs治療肝損傷的作用途徑之一。第二部分臍帶間充質(zhì)干細胞體外定向分化為肝細胞的實驗研究目的:建立并優(yōu)化體外誘導間充質(zhì)干細胞定向分化為肝細胞的方法,并對誘導后的細胞進行肝細胞的特征和功能測定。方法:1取正常雄性SD大鼠和急性肝損傷模型大鼠,將肝臟灌流后手動勻漿,制備肝勻漿上清提取物(liver homogenate supernatant,LHS)和CCl4-LHS,并配制體外誘導培養(yǎng)基。LHS的應用濃度為100 mg/m L,CCl4-LHS的應用濃度為50 mg/m L。2實驗分組取第3代UCMSCs,以1.2×105個/孔的細胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)1-2天,待細胞長至80%匯合,吸棄培養(yǎng)液,加入誘導培養(yǎng)基。實驗組分為8組,分別為:(1)LHS對照組,(2)LHS-3d組,(3)LHS-5d組,(4)LHS-7d組,(5)CCl4-LHS對照組,(6)CCl4-LHS-3d組,(7)CCl4-LHS-5d組,(8)CCl4-LHS-7d組。對照組正常培養(yǎng),LHS組加入LHS,CCl4-LHS組加入CCl4-LHS,于不同時間點3 d,5 d,7d進行處理,收集細胞及細胞上清液。3應用Western blot技術和Real time-PCR技術,研究誘導后細胞AFP、CK18、ALB、CYP450酶系蛋白和基因水平表達的變化。4應用HPLC/MS/MS測定CYP450酶代謝產(chǎn)物的方法,來評估CYP450酶系CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4的代謝活性。1體外LHS和CCl4-LHS誘導UCMSCs對細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察,對照組UCMSCs為均一的長梭形的成纖維樣細胞,呈旋渦狀排列生長,LHS誘導后,細胞兩級收縮,胞體變短,長梭形細胞逐漸減少,3 d時觀察可見大量異形細胞;5 d時觀察可見梭形細胞繼續(xù)減少,可見部分細胞呈三角形或多角形;誘導培養(yǎng)7d后,大多數(shù)細胞呈不規(guī)則形或類圓形。CCl4-LHS誘導后1 d,倒置顯微鏡下觀察即可見細胞開始收縮,3 d時細胞呈圓形或橢圓形,5 d,7d細胞形態(tài)變化不大。2體外LHS和CCl4-LHS誘導UCMSCs對肝細胞相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示:與對照組相比,LHS和CCl4-LHS誘導不同時間組AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP 2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達均顯著增強(P0.05),其中,LHS組AFP的表達量在誘導5 d時達到峰值,隨后下降;CK18和ALB的表達量均隨誘導時間延長而增加(P0.05),CYP450酶家族蛋白在5 d或7d表達量最大;CCl4-LHS組AFP的表達量在誘導3 d時達到峰值,隨后下降;ALB的表達量均隨誘導時間延長而增加,CK18和CYP450酶家族蛋白均在3 d表達量最大(P0.05)。與LHS-3d組相比,CCl4-LHS-3d組6個指標表達水平顯著升高;4個指標表達水平顯著降低;與LHS-5d組相比,CCl4-LHS-5d組2個指標表達水平顯著升高,8個指標表達水平顯著降低;與LHS-7d組相比,CCl4-LHS-7d組8個指標表達水平顯著降低(P0.05)。3體外LHS和CCl4-LHS誘導UCMSCs對肝細胞相關基因表達的影響RT-PCR結果可見:與對照組相比,LHS和CCl4-LHS誘導不同時間組AFP、CK18、ALB、CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達均顯著增強(P0.05),其中,兩組AFP的表達量均在誘導3 d時達到峰值,ALB和CK18的表達量均隨誘導時間延長而增加,LHS組CYP450酶家族中CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的基因表達量在5 d時達到峰值,CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2E1的基因表達量在7d時最大(P0.05);CCl4-LHS組CYP450酶家族中CYP1A1/2、CYP2A6的表達量在5 d達最大,CYP2C9的表達量在3 d達結果:最大,CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的表達量在7d達峰(P0.05)。與LHS-3d組相比,CCl4-LHS-3d組9個指標的表達水平顯著升高,1個指標表達水平顯著降低;與LHS-5d組相比,CCl4-LHS-5d組4個指標的表達水平顯著升高,5個指標的表達水平顯著降低,1個指標的表達水平不變;與LHS-7d組相比,CCl4-LHS-7d組3個指標的表達水平顯著升高,6個指標表達水平顯著降低,1個指標的表達水平不變(P0.05)。4體外LHS和CCl4-LHS誘導UCMSCs對CYP450酶家族代謝活性的影響添加6種CYP450酶代謝底物后,檢測結果顯示:檢測到5種代謝產(chǎn)物,分別為1,7-二甲基黃嘌呤,7-羥基香豆素,4-羥基甲苯磺丁脲,6-羥基氯唑沙宗,1-羥基咪達唑侖,說明誘導后的細胞具備CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4酶的活性,經(jīng)過蛋白定量后的結果顯示,與對照組相比,各組酶產(chǎn)物均顯著升高(P0.05);LHS組CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶活性均在5d組最高;CCl4-LHS組CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1和CYP3A4酶活性均在3d組最高;CYP2C9酶活性各組間無顯著性差別(P0.05)。與LHS-3d組相比,CCl4-LHS-3d組3個指標的表達水平顯著升高,1個指標表達水平顯著降低;1個指標的表達水平不變;與LHS-5d組相比,CCl4-LHS-5d組3個指標的表達水平顯著降低,2個指標的表達水平不變;與LHS-7d組相比,CCl4-LHS-7d組1個指標表達水平顯著降低,4個指標的表達水平不變(P0.05)。5體外LHS和CCl4-LHS誘導UCMSCs對細胞合成分泌白蛋白和尿素的影響與對照組相比,LHS各誘導組分泌的ALB均顯著增高,且隨誘導時間增長分泌量升高(P0.05);與對照組相比,誘導組分泌的尿素均顯著增高,且隨誘導時間增長分泌量升高(P0.05)。與對照組相比,CCl4-LHS各誘導組分泌的ALB均顯著增高,其中LHS-3d組分泌量最大,之后逐漸降低(P0.05);與對照組相比,CCl4-LHS各誘導組分泌的尿素均顯著增高,其中LHS-3d組分泌量最大,之后逐漸降低(P0.05)。與LHS-3d組相比,CCl4-LHS-3d組ALB和尿素分泌水平均顯著升高;與LHS-5d組相比,CCl4-LHS-5d組ALB分泌水平顯著升高,尿素分泌水平顯著降低;與LHS-7d組相比,CCl4-LHS-7d組ALB分泌水平不變,尿素分泌水平顯著降低(P0.05)。結論:1體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可誘導UCMSCs定向分化為具有肝細胞形態(tài)特征的細胞,其高表達肝細胞標志和功能蛋白及其基因,具備部分CYP450酶活性,能夠分泌白蛋白和尿素。說明正常肝組織和肝損傷微環(huán)境均可誘導UCMSCs定向分化為具有部分肝細胞功能的細胞,這可能是UCMSCs改善肝功能的作用途徑之一。2體外肝損傷微環(huán)境誘導UCMSCs相比于正常肝組織微環(huán)境,誘導效果相似,所需誘導濃度更低,誘導時間更短,因此具有更高的效率,提示肝損傷微環(huán)境更有利于UCMSCs向肝細胞的定向分化。第三部分LKB1/AMPK/HNF-4α信號通路在臍帶間充質(zhì)干細胞定向分化為肝細胞中的作用目的:研究LKB1/AMPK/HNF-4α信號通路在UCMSCs定向分化為肝細胞中的作用方法:1通過基因表達譜芯片實驗篩選UCMSCs定向分化為肝細胞后變化的基因,并進行IPA分析,尋找關鍵基因上游相關信號通路。2實驗分組基因表達譜芯片實驗分為2組:對照組和LHS組,每組3個復孔,分別為C-1,C-2,C-3,LHS-1,LHS-2,LHS-3。信號通路實驗分為6組:(1)對照組(2)CCl4-LHS-3d組(3)AMPK激活劑AICAR組(1 m M)(4)AMPK抑制劑Dorsomorphin 2 HCl(DM)組(10μM)(5)CCl4-LHS+AICAR組(6)CCl4-LHS+DM組。3采用Western blot技術和Real time-PCR技術,檢測誘導后LKB1、AMPK、HNF-4α等蛋白和基因水平的變化;采用Real time-PCR技術觀察HNF-4α抑制劑BI6015對誘導分化的影響;采用Western blot技術觀察AMPK激活劑AICAR和拮抗劑Dorsomorphin 2 HCl對誘導分化的影響。1芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)控通過做Signal Histogram圖、Relative Signal Box Plot圖、Pearson's Correlation(signal)圖和PCA圖,對基因譜芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,結果顯示數(shù)據(jù)質(zhì)控良好。2芯片數(shù)據(jù)分析結果1)有顯著差異表現(xiàn)的基因數(shù)目根據(jù)實驗設計的要求,基因表現(xiàn)有顯著差異的篩選標準為必須符合|FC|要大于2,且P值要小于0.05。結果顯示與對照組相比,LHS組上調(diào)基因數(shù)為1167,下調(diào)基因數(shù)為1337。結果通過火山圖,散點圖,聚類圖直觀展示。2)芯片數(shù)據(jù)分析結果的Pathway分析根據(jù)篩選出的差異基因,進行Pathway富集分析。根據(jù)KEGG與BIOCARTA中所有pathway的基因信息,將差異基因進行富集分析,根據(jù)P值排序后,我們選取前十位的加以展示。3)芯片數(shù)據(jù)分析結果的信號通路柱狀圖信號通路柱狀圖展示了差異基因在經(jīng)典信號通路中的富集情況。差異基因所調(diào)控的經(jīng)典通路由IPA所收集歸納的800條信號、代謝通路所總結;所有的信號通路使用-Log P進行排序。4)AMPK相關信號通路圖信號通路圖展示了實驗數(shù)據(jù)對信號通路的信號傳遞的影響。在信號通路圖中給出了各種分子的信號傳遞過程和差異基因的上下調(diào)情況,通過分子激活預測,對其他基因進行了激活抑制預測。結果展示了與AMPK相關信號通路的各種分子的傳遞過程。5)差異基因的上游調(diào)控分析上游調(diào)控因子分析表展示了本實驗中所有的差異基因的上游調(diào)控因子。上游調(diào)控因子可以是任何能夠影響基因表達的分子,它覆蓋了全部的分子類型,包括轉(zhuǎn)錄因子,細胞活素,小RNA,受體,激酶,化學分子和藥物。IPA使用了Activation z-score算法,對上游調(diào)控子的激活或者抑制進行預測,并降低了由于隨機數(shù)據(jù)造成的顯著預測。結果顯示:肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor-4α;HNF-4α)被預測為激活。6)HNF-4α上游調(diào)控子網(wǎng)絡圖結果:上游調(diào)控子網(wǎng)絡圖展示了上游調(diào)控因子和與其直接相關的并存在于數(shù)據(jù)集中的下游分子之間的相互作用關系。3體外LHS和CCl4-LHS誘導對UCMSCs的HNF-4α基因和蛋白水平表達的影響RT-PCR結果可見:與LHS對照組相比,LHS誘導不同時間組HNF-4α的表達均顯著增強(P0.05),且表達量均隨誘導時間延長而增加,7d組表達水平達峰值;與CCl4-LHS對照組相比,CCl4-LHS誘導不同時間組HNF-4α的表達均顯著增強,其中,3d與5d組表達水平無顯著性差異,7d組與3d、5d組相比,表達水平顯著升高(P0.05)。與LHS組各時間點相比,CCl4-LHS組HNF-4α的表達均顯著增強(P0.05)。Western blot結果顯示:與LHS對照組相比,LHS誘導不同時間組HNF-4α的表達均顯著增強(P0.05),且表達量均隨誘導時間延長而增加,7d表達量最大(P0.05);與CCl4-LHS對照組相比,CCl4-LHS誘導不同時間組HNF-4α的表達均顯著增強,其中,表達量在誘導3d時達到峰值,隨后下降(P0.05)。與LHS組各時間點相比,CCl4-LHS組HNF-4α的表達均顯著增強(P0.05)。4體外BI6015對CCl4-LHS誘導UCMSCs定向分化的影響RT-PCR結果可見:與對照組相比,CCl4-LHS-3d組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表達均顯著增強(P0.05),BI6015組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表達均顯著降低(P0.05),BI6015+CCl4-LHS組HNF-4α、AFP、CYP3A4的表達均顯著降低(P0.05),ALB表達顯著升高(P0.05);與CCl4-LHS-3d組相比,BI6015組和BI6015+CCl4-LHS組HNF-4α、AFP、CK18、ALB和CYP3A4的表達均顯著降低(P0.05);與BI6015組相比,BI6015+CCl4-LHS組AFP、CK18和ALB表達均顯著升高(P0.05)。5體外CCl4-LHS誘導對UCMSCs的AMPK和LBK1基因表達的影響RT-PCR結果可見:與對照組相比,CCl4-LHS-3d組AMPKα1、AMPKα2和LKB1的表達均顯著增強(P0.05)。Western blot結果顯示:與對照組相比,CCl4-LHS-3d組LKB1和AMPK的表達水平無顯著性變化,p-LKB1(S428)、p-LKB1(T189)、p-AMPK的表達水平均顯著降低(P0.05)。6體外AICAR和DM對CCl4-LHS誘導UCMSCs定向分化的影響Western blot結果顯示:HNF-4α表達水平,與對照組相比,CCl4-LHS-3d組、DM組和CCl4-LHS+DM組顯著升高,AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著降低(P0.05);與CCl4-LHS-3d相比,AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著降低,CCl4-LHS+DM組顯著升高(P0.05);與AICAR組相比,DM組和CCl4-LHS+DM組顯著升高(P0.05);與DM組相比,CCl4-LHS+AICAR組顯著降低,CCl4-LHS+DM組顯著升高(P0.05)。AMPK表達水平各組間無顯著性差異。p-AMPK表達水平,與對照組相比,CCl4-LHS-3d組、DM組和CCl4-LHS+DM組顯著降低,AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著升高(P0.05);與CCl4-LHS-3d相比,AICAR組和CCl4-LHS+AICAR組顯著升高,CCl4-LHS+DM組顯著降低(P0.05);與AICAR組相比,DM組和CCl4-LHS+DM組顯著降低(P0.05),與DM組相比,CCl4-LHS+AICAR組顯著升高,CCl4-LHS+DM組顯著降低(P0.05)。7體外CCl4-LHS誘導對UCMSCs的PI3K和AKT基因表達的影響RT-PCR結果可見:與對照組相比,CCl4-LHS-3d組PI3K的表達顯著增強(P0.05)。Western blot結果顯示:與對照組相比,CCl4-LHS-3d組PI3K和p-AKT表達均顯著升高(P0.05)。結論:1體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可通過上調(diào)HNF-4α的基因和蛋白表達水平,誘導UCMSCs定向分化為肝細胞,且肝損傷微環(huán)境上調(diào)HNF-4α的基因和蛋白水平高于正常肝組織微環(huán)境誘導結果;抑制HNF-4α基因表達可抑制肝細胞相關標志蛋白基因的表達,提示HNF-4α為啟動UCMSCs向肝細胞定向分化的關鍵基因之一,肝損傷微環(huán)境對HNF-4α表達的影響大于正常肝組織微環(huán)境。2肝損傷微環(huán)境可通過降低LBK1和AMPK磷酸化蛋白表達誘導UCMSCs向肝細胞定向分化;抑制磷酸化AMPK蛋白表達可使HNF-4α表達升高,增加磷酸化AMPK蛋白表達可使HNF-4α表達降低,提示AMPK磷酸化蛋白表達與HNF-4α表達呈負相關,LBK1/AMPK/HNF-4α信號通路在肝損傷微環(huán)境誘導的UCMSCs向肝細胞定向分化中發(fā)揮重要作用。綜上所述,本實驗以肝損傷模型大鼠為治療對象,研究UCMSCs對其治療效果及其分化機制;以體外正常肝組織和肝損傷微環(huán)境誘導UCMSCs定向分化為肝細胞為平臺研究其分化的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植UCMSCs對急性肝損傷和肝纖維化模型大鼠的治療作用明顯,移植的UCMSCs可以遷移并定居在受損肝臟組織,并且在肝臟組織定向分化為具有肝細胞特異標志物的肝細胞,提示其為UCMSCs治療肝損傷類疾病發(fā)揮作用的途徑之一。正常肝組織和肝損傷微環(huán)境可在體外誘導UCMSCs定向分化為具有肝細胞形態(tài)特征的細胞,其高表達肝細胞的標志和功能蛋白及基因,具備部分CYP450酶活性,能夠分泌白蛋白和尿素,說明此誘導方法是一種可以誘導UCMSCs定向分化為肝細胞的方法。肝組織微環(huán)境作用下UCMSCs分化而來的肝細胞具有部分肝細胞功能,這可能是UCMSCs改善肝功能的作用途徑之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs定向分化為肝細胞后HNF-4α基因和蛋白水平顯著升高,LBK1和AMPK磷酸化蛋白表達水平顯著降低,說明LKB1/AMPK/HNF-4α信號通路在UCMSCs定向分化為肝細胞的過程中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575

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本文編號：1321126