本文關(guān)鍵詞：羥基紅花黃色素A抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞活化的靶點及機制研究　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的肺成纖維細胞是肺臟疏松結(jié)締組織中主要細胞之一。它在生理狀態(tài)下可維持肺臟組織正常形態(tài),能及時修復(fù)損傷組織。病理狀態(tài)下肺臟成纖維細胞通過自身異常增殖、轉(zhuǎn)型和合成分泌大量細胞外基質(zhì)等功能改變參與特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的形成過程。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可誘導(dǎo)成纖維細胞活化,是致纖維化最為關(guān)鍵的細胞因子之一,故探究有效方法及手段干預(yù)TGF-β1介導(dǎo)的肺成纖維細胞活化過程,有希望成為治療肺纖維化的新策略。羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)是從傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花中分離的水溶性化合物,具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、保護心肌等作用,HSYA抗肝、腎纖維化的研究已有報道。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn):HSYA能有效緩解博萊霉素誘發(fā)的大鼠和小鼠肺纖維化;緩解煙熏-脂多糖誘發(fā)慢阻肺大鼠晚期肺纖維化;抑制脂多糖誘發(fā)的急性呼吸窘迫綜合癥小鼠肺部纖維化相關(guān)因子的表達;抑制TGF-β1誘導(dǎo)人肺癌細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。但HSYA是否能夠直接抑制TGF-β1誘導(dǎo)下肺成纖維細胞的活化,其具體作用靶點及機制,除我們研究室之外,目前尚無研究報道。因此,本研究主要探討HSYA對TGF-β1所激活的肺成纖維細胞在IPF過程中具有重要意義的一些功能,包括細胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)合成和降解等,探索了其作用靶點與作用機制,為HSYA應(yīng)用于臨床抗IPF治療提供一定的實驗依據(jù)和理論支持。方法第一部分:HSYA抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞活化以人胚肺成纖維細胞MRC-5為研究對象,給予HSYA和/或TGF-β1Ⅰ型受體激酶的抑制劑SB431542預(yù)處理,后給予TGF-β1進行誘導(dǎo),通過MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tet razolium inner salt]法和Ed U(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)染色法檢測HSYA對TGF-β1作用下細胞增殖的影響,以細胞劃痕實驗檢測HSYA對TGF-β1誘導(dǎo)細胞遷移的影響,Real-time PCR、Western blot和免疫細胞染色檢測HSYA對TGF-β1刺激成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的標記蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和細胞外基質(zhì)的主要成分膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠalpha 1,COL1A1)、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達變化,采用Western blot法檢測HSYA對TGF-β1刺激下成纖維細胞合成調(diào)控細胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2)的表達變化,觀察HSYA抑制TGF-β1誘發(fā)MRC-5功能活化的作用。第二部分:HSYA抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞活化的機制研究1.以MRC-5細胞為研究對象,給予HSYA和/或TGF-β1Ⅰ型受體激酶的抑制劑SB431542預(yù)處理,后給予TGF-β1進行誘導(dǎo),Western blot檢測HSYA抑制TGF-β1誘發(fā)的細胞TGF-β1/Smad信號通路主要信號因子Smad2、Smad3磷酸化的作用,采用Western blot和細胞免疫熒光法檢測TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3入核轉(zhuǎn)運,雙熒光素酶報告基因法檢測HSYA抑制TGF-β1誘發(fā)Smad3與膠原蛋白Ⅰ啟動子中Smad結(jié)合元件(Smad binding element,SBE)結(jié)合的作用,以Western blot法檢測HSYA抑制TGF-β1誘發(fā)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)MAPK和p38 MAPK以及PI3K/Akt信號通路主要信號因子Akt磷酸化的作用,探索HSYA抑制TGF-β1誘發(fā)MRC-5多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。2.以MRC-5細胞為研究對象,給予HSYA和/或ERK特異抑制劑PD98059或Smad3特異抑制劑SIS3預(yù)處理,后給予TGF-β1進行誘導(dǎo),初步探討HSYA對TGF-β1刺激下Smad3和ERK通路間交互作用的影響。第三部分:HSYA抑制TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞激活作用靶點的探索以MRC-5細胞為研究對象,通過Western blot法檢測HSYA對TGF-β1作用下成纖維細胞膜TGF-β1Ⅱ型受體(TGF-β1 typeⅡreceptor,TβRⅡ)和TGF-β1Ⅰ型受體(TGF-β1 typeⅠreceptor,TβRⅠ)蛋白表達的影響。采用流式細胞儀檢測HSYA拮抗FITC-TGF-β1與MRC-5細胞受體結(jié)合的作用。采用基因沉默的方法沉默細胞膜上TβRⅡ,以下游α-SMA、collagenⅠ、FN的表達水平及Smad2、Smad3、ERK磷酸化為檢測指標,觀察TβRⅡ被沉默后HSYA藥效的變化,以探索其作用靶點。結(jié)果第一部分:HSYA能夠抑制TGF-β1誘發(fā)的MRC-5細胞增殖和遷移。HSYA能降低α-SMA的表達,從而抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)化。HSYA可以抑制TGF-β1所致MRC-5細胞外基質(zhì)主要成分COL1A1和FN的表達。另外HSYA對TGF-β1刺激下MRC-5細胞MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的表達變化無影響。以上結(jié)果表明,HSYA能夠抑制TGF-β1所致成纖維細胞活化后主要功能(細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)化及細胞外基質(zhì)合成)的異常,發(fā)揮其抗肺成纖維細胞活化、減輕肺組織重構(gòu)的作用。第二部分:1.HSYA可以緩解TGF-β1誘發(fā)的Smad2、Smad3磷酸化水平的升高與Smad2、Smad3的核轉(zhuǎn)位;HSYA可抑制TGF-β1所致Smad3與COL1A1啟動子SBE的結(jié)合;HSYA可以抑制TGF-β1誘發(fā)的ERK/MAPK蛋白磷酸化水平的升高;TGF-β1未誘發(fā)JNK/MAPK、p38 MAPK和Akt磷酸化水平升高,而HSYA也未對其產(chǎn)生影響,以上結(jié)果表明,HSYA能夠影響TGF-β1介導(dǎo)的Smad通路和ERK/MAPK通路。2.當ERK通路被阻斷后,HSYA抑制Smad3磷酸化的藥效已不明顯,該結(jié)果提示,HSYA抑制Smad3磷酸化可能依賴于ERK通路。當Smad3通路被阻斷后,HSYA依然可抑制ERK磷酸化,該結(jié)果提示,HSYA抑制ERK磷酸化可能不依賴于Smad通路。第三部分:Western blot結(jié)果說明,HSYA對TGF-β1誘發(fā)的TβRⅡ和TβRⅠ蛋白表達水平變化未產(chǎn)生作用。受體結(jié)合實驗結(jié)果提示,HSYA可拮抗FITC-TGF-β1與MRC-5細胞膜上受體的結(jié)合�；虺聊椒ǔ聊毎ど蟃βRⅡ后,TGF-β1-TβRⅡsi RNA組與(TGF-β1+HSYA)-TβRⅡsi RNA組比較,α-SMA、collagenⅠ、FN蛋白表達水平及Smad2、Smad3、ERK磷酸化水平變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明TβRⅡ敲低后HSYA的藥效已不明顯,提示TβRⅡ可能是HSYA抑制細胞α-SMA、collagenⅠ、FN蛋白表達及Smad2、Smad3、ERK磷酸化的作用靶點。結(jié)論HSYA可能通過阻斷TGF-β1與MRC-5細胞膜上TβRⅡ結(jié)合,抑制Smad和ERK通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而抑制TGF-β1誘發(fā)成纖維細胞功能的異常變化,達到抗成纖維細胞活化,緩解肺纖維化的目的。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：1321086