本文關鍵詞：Cdk5通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及神經調節(jié)素1β抗凋亡機制研究　出處：《青島大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:在前期研究工作基礎上,研究大鼠腦缺血2h再灌注22h后,Cdk5信號通路的表達情況;探討NRG1β對Cdk5通路的影響、能否通過Cdk5通路抑制神經細胞凋亡,及其具體作用機制和關鍵環(huán)節(jié),為將來應用NRG1β防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。方法:(1)成年健康雄性Wistar大鼠360只,應用線栓法經左側頸外-頸內動脈插線建立大腦中動脈缺血再灌注(MCAO/R)模型,隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(Sham)組55只、模型(MCAO/R)組、治療(NRG1β)組、抑制劑+治療(Ros+NRG1β)組和抑制劑(Ros)組,每組動物55只。(2)Sham組線栓不入顱、不建立MCAO模型,2h后經ECA殘端向ICA內注射0.1mol/L PBS 5μl;MCAO/R組建立MCAO/R模型后2h拔除線栓,同步經ECA殘端向ICA內注射0.1mol/L PBS 5μl;NRG1β組動物缺血2h后拔除線栓,同時經ECA殘端向ICA內微量注射8%NRG1β5μl(2μg/kg);Ros+NRG1β組在插線前經ECA殘端向ICA注射Roscovine 5μl,缺血2h后拔除線栓實現(xiàn)再灌注,同時給予8%NRG1β5μl;Ros組注射Roscovine同Ros+NRG1β組,但缺血2h后拔除線栓時同步給予0.1mol/l PBS 5μl。(3)治療后(或再灌注后)22h應用改良神經功能缺損評分(m NSS評分)測試動物神經功能,干濕重法測量大鼠腦組織含水量,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測量腦梗死體積,HE染色和甲苯胺藍(Nissl)染色觀察神經細胞形態(tài)結構,透射電鏡(TEM)觀察神經元超微結構,原位TUNEL法和流式細胞學技術(FCM)檢測細胞凋亡,免疫組化(IHC)和Western Blot檢測Calpain1、p35/p25、Cdk5、p-Tau蛋白在神經元內的定位定量表達。結果:(1)NRG1β對大鼠神經行為功能的影響:Sham組無神經行為功能缺損表現(xiàn),m NSS評分0分;MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組大鼠存在不同程度神經行為功能缺損的表現(xiàn),m NSS評分較Sham組顯著升高(P0.05),NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組大鼠神經行為功能缺損較MCAO/R組均有改善,m NSS評分較MCAO/R組有不同程度下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);Ros+NRG1β組大鼠m NSS評分最低,與其他各組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)NRG1β對大鼠腦組織含水量的影響:MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組大鼠腦組織含水量顯著高于Sham組(P0.05);NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組含水量較MCAO/R組均有下降(P0.05);NRG1β組與Ros組比較腦組織含水量無明顯差異(P0.05);Ros+NRG1β組較MCAO/R組、NRG1β組、Ros組腦組織含水量顯著降低(P0.05)。(3)NRG1β對大鼠腦梗死體積的影響:Sham組未見腦梗死病灶;MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組與Sham組相比,腦梗死體積不同程度地增大,差異顯著(P0.05);MCAO/R組梗死體積較NRG1β組、Ros組及Ros+NRG1β組均明顯增大,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);NRG1β組與Ros+NRG1β組腦梗死體積較Ros組顯著減小(P0.05),而Ros+NRG1β組腦梗死體積最小,與其他各組比較均有顯著性差異(P0.05)。(4)NRG1β對神經細胞形態(tài)結構的影響:HE染色和Nissl染色均顯示:Sham組形態(tài)結構正常、未見明顯變性壞死的神經元細胞,變性細胞指數(shù)(DCI)低;MCAO/R組、NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組與Sham組相比,DCI明顯升高,出現(xiàn)不同程度的神經元細胞損傷情況,如細胞排列紊亂、固縮、胞膜破裂,胞核消失,空泡樣變等,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組DCI較MCAO/R組有不同程度地下降,其形態(tài)結構、神經元細胞損傷介于Sham組與MCAO/R組之間,差異有顯著性(P0.05);Ros+NRG1β組較NRG1β組、Ros組DCI均有下降,變性壞死的神經元細胞更為減少,細胞損傷程度減輕,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)NRG1β對神經元超微結構的影響:Sham組神經元超微結構正常,細胞核大而圓、染色質分布均勻,細胞器豐富,細胞膜、核膜完整,神經元軸突正常、微管正常,偶見凋亡的神經細胞;MCAO/R組與Sham組相比,神經元損傷嚴重,細胞固縮,細胞器數(shù)量明顯降低甚至消失、空泡變性,形成凋亡小體、神經細胞凋亡顯著;NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組神經元損傷介于Sham組和MCAO/R組之間;NRG1β組與Ros組神經元超微結構接近;Ros+NRG1β組損傷更輕、神經細胞凋亡較NRG1β組及Ros組亦有改善,部分出現(xiàn)空泡,細胞結構較正常完整、邊緣清楚,細胞器損傷亦減輕,細胞連接較緊密。(6)NRG1β對細胞凋亡的影響:(1)TUNEL法顯示:Sham組頂葉皮層神經元細胞淺染為淡藍色,絕大部分細胞結構完整、排列整齊,胞膜光滑,胞漿豐富,細胞核清晰可見,細胞間質無水腫等;偶見細胞凋亡;MCAO/R組可見大量神經細胞凋亡,細胞排列紊亂、固縮、胞膜皺縮、細胞質被染成棕色,胞核被染成褐色或棕褐色,或固縮、碎裂,甚至崩解、形成空泡;NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組神經元細胞形態(tài)改善、排列較為整齊,結構相對完整,部分神經細胞核固縮、碎裂、形成空泡;Ros+NRG1β組,較NRG1β組、Ros組明顯改善,變性壞死神經元減少。(2)FCM法與TUNEL法均顯示:MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組與Sham組相比,早期凋亡細胞指數(shù)(EACI)、凋亡細胞指數(shù)(ACI)均顯著升高(P0.05)。Ros+NRG1β組、NRG1β組、Ros組與MCAO/R組相比,EACI、ACI不同水平下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Ros+NRG1β組與NRG1β組、Ros組比較,EACI、ACI均有下降,差異有顯著性(P0.05)。(7)NRG1β對蛋白定位表達的影響:IHC染色顯示:(1)Calpain 1:MCAO/R組較Sham組,陽性細胞數(shù)指數(shù)(PCI)顯著升高(P0.05);NRG1β組、Ros+NRG1β組,PCI較MCAO/R組明顯降低(P0.05),而兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P0.05);Ros組Calpain 1表達較MCAO/R組無顯著性差異(P0.05),與NRG1β組、Ros+NRG1β組差異明顯(P0.05)。(2)Cdk5:與Sham組比較,MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組PCI明顯升高,差異有顯著性(P0.05);而MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組PCI之間兩兩比較,差異無顯著性(P0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R組、Ros組p35/p25表達較Sham組明顯增強,PCI顯著升高,(P0.05),但兩兩比較無顯著差異(P0.05);NRG1β組、Ros+NRG1β組p35/p25表達較MCAO/R組、Ros組明顯減少(P0.05),而NRG1β組與Ros+NRG1β組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組,與Sham組比較,蛋白表達明顯增加,PCI顯著升高(P0.05);NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組,PCI較MCAO/R組不同程度下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);Ros+NRG1β組,與NRG1β組和Ros組比較PCI降低,差異顯著(P0.05);與Ros組比較,NRG1β組p-Tau表達較低,PCI下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(8)NRG1β對蛋白定量表達的影響:Western blot顯示:(1)Calpain 1:MCAO/R組較Sham組,Calpain 1相對蛋白含量明顯增加(P0.05);NRG1β組、Ros+NRG1β組,相對蛋白含量較MCAO/R組明顯降低(P0.05),而其兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P0.05);Ros組Calpain 1表達較MCAO/R組無顯著性差異(P0.05),與NRG1β組、Ros+NRG1β組比較則均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)Cdk5:與Sham組比較,MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組Cdk5相對蛋白含量明顯升高(P0.05);而MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組間兩兩比較,差異無顯著性(P0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R組、Ros組較Sham組p35/p25蛋白表達明顯增加,相對蛋白含量均顯著升高(P0.05),但MCAO/R組與Ros組蛋白表達無差異(P0.05);NRG1β組、Ros+NRG1β組蛋白表達較MCAO/R組、Ros組明顯減少(P0.05),而NRG1β組與Ros+NRG1β組蛋白相對含量比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R組、NRG1β組、Ros+NRG1β組、Ros組,與Sham組比較p-Tau蛋白表達明顯增加、相對蛋白含量顯著升高(P0.05);NRG1β組、Ros組、Ros+NRG1β組,p-Tau表達較MCAO/R組不同程度下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);Ros+NRG1β組p-Tau相對蛋白含量最低,與NRG1β組和Ros組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);與Ros組比較,NRG1β組p-Tau蛋白表達較低,相對蛋白含量少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:腦缺血再灌注損傷發(fā)生后,Cdk5通路過度激活,導致神經元細胞凋亡;其特異性抑制劑Roscovitine可以阻斷Cdk5通路誘導凋亡的作用,有利于腦缺血再灌注損傷后神經功能恢復。神經調節(jié)素1β可以抑制Cdk5通路中Calpain1、p35/p25、p-Tau的表達,減少神經元凋亡,縮小腦梗死體積,改善神經行為功能,在腦缺血再灌注損傷后發(fā)揮神經保護作用。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743

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