本文關(guān)鍵詞：TF-MPs促進(jìn)腫瘤相關(guān)高凝狀態(tài)作用機制的探討　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腫瘤患者常常合并急慢性動靜脈血栓事件,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。早在1856年Trousseau第一次描述了腫瘤相關(guān)系統(tǒng)性血栓栓塞事件,之后將腫瘤合并游走性靜脈炎統(tǒng)稱為Trousseau’s syndrome。隨著人們對這一病癥的了解,它所涉及范圍已涵蓋所有癌癥高凝狀態(tài)(Cancer Associated Hypercoagulability,CAH)動靜脈血栓栓塞病癥。高凝狀態(tài)使患者處于易栓體質(zhì),易發(fā)生下肢靜脈血栓栓塞(Venous Thromboem Bolism,VTE)、肺栓塞(Pulmonary Embolism,PE)、彌散性血管內(nèi)凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)等并發(fā)癥,極大影響了腫瘤患者的生存率。同時,這種異常的高凝背景又進(jìn)一步加速腫瘤細(xì)胞的生長以及播散,它可以使循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞更容易沉淀下來,發(fā)生局部種植;并且,活化的血小板在腫瘤細(xì)胞周圍形成血小板包衣,使腫瘤細(xì)胞逃避NK細(xì)胞免疫攻擊。腫瘤患者體內(nèi)的凝血狀態(tài)的激活與炎癥、血栓、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等之間形成互相關(guān)聯(lián)、互相促進(jìn)的網(wǎng)絡(luò)。所以,對腫瘤高凝狀態(tài)的正確認(rèn)知以及及時有效的預(yù)防治療,對提高腫瘤患者生活質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。在眾多腫瘤高凝狀態(tài)觀察研究中,以VTE、PE為主要研究范圍,對于神經(jīng)系統(tǒng)動脈栓塞關(guān)注較少。一個尸檢報告結(jié)果顯示15%的癌癥死亡患者存在明確病理診斷的卒中,但只有大約一半的患者生前被發(fā)現(xiàn)臨床癥狀的卒中。與傳統(tǒng)腦卒中相比,腫瘤合并缺血性卒中的患者預(yù)后更差,有更長的住院時間。目前為止,對這類患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療等措施仍不明確。神經(jīng)科醫(yī)師經(jīng)常會遇到無明確病因的隱匿性梗死,這些隱匿性梗死的發(fā)病率大約為20-46%,人們嘗試認(rèn)為未明腫瘤引起的高凝狀態(tài)可能是這類隱匿梗塞的病因之一,若能明確其背后隱藏致病機制,將會使這部分患者得到及時有效的治療及二級預(yù)防,很大的提高患者生活質(zhì)量。目前臨床中針對腫瘤高凝的預(yù)防多采用腫瘤靜脈血栓栓塞事件防治專家共識,然而,由于條件限制等原因,未能全面推廣;又由于腫瘤患者血栓防治涉及多學(xué)科,循證醫(yī)學(xué)資料多而龐雜,缺少系統(tǒng)歸納;另外盡管血栓預(yù)防的概念已經(jīng)被普遍接受,但缺乏針對腫瘤患者血栓防治的循證醫(yī)學(xué),因而限制了腫瘤患者血栓防治的工作。目前,專家共識中針對血栓預(yù)防的納入標(biāo)準(zhǔn)主要來自風(fēng)險評估量表,缺乏量化、標(biāo)準(zhǔn)化的血液檢測指標(biāo)指導(dǎo)臨床防治,所以,急切需要類似血管病危險因素(血脂、血糖、尿酸等)的血液測量指標(biāo)來幫助臨床發(fā)現(xiàn)血栓事件發(fā)生的高危人群,及時給予預(yù)防治療,從而提高患者生活質(zhì)量及生存率。關(guān)于腫瘤高凝狀態(tài)的發(fā)生機制研究中常被提到的相關(guān)因素有:組織因子(Tissue Factor,TF)、微粒(Micro-particles,MP)、癌促凝物質(zhì)(Cancer Pro-coagulant,CP)等。組織因子是其中重要的生物活性物質(zhì),它可以與微粒相結(jié)合成組織因子微粒(Tissue Factor-positive Microparticles TF-MPs)而發(fā)揮作用。在實體腫瘤、血液腫瘤研究中發(fā)現(xiàn),患者體內(nèi)組織因子微粒含量高于非腫瘤患者,但并未闡明升高的TF-MPs是腫瘤高凝狀態(tài)的產(chǎn)生原因還是伴隨高凝產(chǎn)生的結(jié)果。動物實驗研究發(fā)現(xiàn),在動物體內(nèi)注入人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的TF-MPs可產(chǎn)生類似DIC樣反應(yīng)、血小板驟降,提示其有可能是引起高凝的原因之一。TF-MPs結(jié)構(gòu)包含TF、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine PS),二者共同發(fā)揮促進(jìn)凝血作用,使腫瘤患者出現(xiàn)凝血功能異常。對于易栓體質(zhì)人群來說,早期及時預(yù)防治療至關(guān)重要。然而,目前臨床上沒有一項能夠很好的預(yù)測血栓事件發(fā)生的客觀檢測指標(biāo),TF-MPs作為腫瘤患者體內(nèi)異常增高促凝物質(zhì)一直處于研究領(lǐng)域的熱點,但其是否可以作為評估腫瘤患者血栓事件發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)目前仍沒有定論。綜上所述,我們推測腫瘤高凝狀態(tài)是腫瘤合并神經(jīng)系統(tǒng)血栓栓塞事件發(fā)病機制之一,尤其對于隱匿性梗死;而TF-MPs升高則誘導(dǎo)腫瘤患者處于高凝易栓狀態(tài)。TF-MPs能否客觀反映臨床高凝狀態(tài)的程度取決于其是否能夠起到促進(jìn)高凝發(fā)生。為了驗證這些問題,我們首先分析了神經(jīng)系統(tǒng)傳統(tǒng)腦梗死(cerebral infarction,CI)與腫瘤合并腦梗死兩類患者人群的臨床綜合特征,分析腫瘤高凝在隱匿性腦梗死發(fā)生中的作用;觀察腫瘤患者體內(nèi)血漿TF-MPs水平的變化,探索其促凝活性以及促凝作用機制,評價血漿TF-MPs作為評價高凝的化驗指標(biāo)可行性。主要研究結(jié)果如下:第一部分腫瘤高凝狀態(tài)誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)動脈血栓事件的臨床觀察目的:探討腫瘤患者合并神經(jīng)系統(tǒng)血栓栓塞事件的臨床特征以及腫瘤高凝在隱匿性梗死中的作用。方法:1根據(jù)急性期腦梗死是否伴有活動期腫瘤病史分為腫瘤相關(guān)梗塞組(實驗組)和單純腦梗死組(對照組)。兩組各58例患者,對兩組患者臨床特征、血液化驗指標(biāo)、影像學(xué)資料等進(jìn)行單因素比較分析。然后以梗死類型診斷為因變量,單因素分析中P小于0.10的因素為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素回歸。2為避免腫瘤與卒中獨立并存對結(jié)果的影響,對實驗組進(jìn)一步分析,進(jìn)行亞組分析,將58例腫瘤患者進(jìn)行根據(jù)Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST)分型標(biāo)準(zhǔn)分為兩組,即隱匿性腦梗死組(Stroke of other undetermined etiology,SUE)和傳統(tǒng)血管病組(Conventional stroke etiology,CSE)。SUE組患者由于除腫瘤病史外未發(fā)現(xiàn)任何梗死危險因素,所以視為腫瘤誘導(dǎo)梗死,CSE組發(fā)病機制為傳統(tǒng)血管病機制誘導(dǎo)梗死。同樣對兩組患者進(jìn)行臨床資料綜合分析,進(jìn)一步剖析腫瘤高凝狀態(tài)在隱匿性梗死中的作用。3應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對亞組中所有患者進(jìn)行血漿TF-MPs測量,在SUE與CSE組間進(jìn)行比較,并且與D-二聚體進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果:1實驗組患者中隱匿性卒中比例、多區(qū)域梗塞比例、D-二聚體指標(biāo)均高于單純梗塞組患者(P0.01)。2回歸分析結(jié)果顯示:D-二聚體(0.3)、APTT、影像學(xué)特點為影響梗死類型診斷的獨立因素,D-二聚體(0.3)越高,為腫瘤合并腦梗死的可能越大,OR(95%CI)為10.474(2.588~42.390);APTT越高,為腫瘤合并梗死的風(fēng)險越小,OR(95%CI)為0.780(0.671~0.906);影像學(xué)特點為多流域梗死的為腫瘤誘導(dǎo)梗死的可能越大,OR(95%CI)為11.055(2.390~51.130)。3亞組分析結(jié)果顯示,SUE組患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率、外周血D-二聚體水平、多流域梗死發(fā)生率均明顯高于CSE組患者(P0.01)。4 SUE組患者的外周血的組織因子微粒(TF-MPs)含量為42.50(27.25~51.25)/μl,CSE組患者的TF-MPs為18.50(13.25~24.00)/μl,SUE組患者高于CSE組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=5.413,P0.001)。5實驗組所有患者的血漿TF-MPs與D-二聚體水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.477,P0.001。結(jié)論:1腫瘤高凝狀態(tài)是隱匿性腦梗死的發(fā)病機制之一。2腫瘤高凝誘導(dǎo)腦梗死具有不同于傳統(tǒng)腦梗死的臨床特征,表現(xiàn)為多流域梗死灶、血漿高D-二聚體、伴活動期腫瘤病史。當(dāng)伴有腫瘤病史的腦梗死患者伴有血漿D-二聚體升高、多流域梗死時,提示其可能為高凝所致并采取有效的防治措施。3腫瘤誘導(dǎo)腦梗死患者體內(nèi)血漿TF-MPs水平高于傳統(tǒng)血管病患者水平,TF-MPs可能與高凝相關(guān)。第二部分乳腺癌患者外周血TF-MPs水平與高凝狀態(tài)關(guān)系的研究目的:分析乳腺癌患者外周血漿TF-MPs水平、高凝狀態(tài)水平的變化,評估亞臨床高凝在乳腺癌患者人群的情況以及其與TF-MPs相關(guān)關(guān)系。方法:將87例首次在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心住院的乳腺癌患者(TNM分期I期10例,II期16例,III期32例,IV期29例;8例為原位癌,15例為導(dǎo)管型乳腺癌,64例為侵襲性癌癥)作為實驗組,20例良性乳腺病患為對照組。1分兩組患者的常規(guī)凝血相關(guān)指標(biāo)包括(凝血酶原時間PT、活化部分凝血酶時間APTT、纖維蛋白原FIB、D-二聚體)。2為更加明確患者體內(nèi)促凝功能,對所有患者進(jìn)行凝血酶生成實驗(Calibrated automated thrombogram,CAT),分析實驗組與對照組患者體內(nèi)高凝狀態(tài)的差異(分析指標(biāo)為Peak、ETP、lag-time、tt Peak)。3應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)測定所有研究對象的血漿TF-MPs水平,比較實驗組與對照組、不同分期乳腺癌患者間的水平差異;在不同腫瘤病理分型間比較水平差異。評估測量TF-MPs對診斷或鑒別診斷的臨床價值。4將患者外周血TF-MPs與凝血相關(guān)指標(biāo)(凝血酶原時間PT、活化部分凝血酶時間APTT、纖維蛋白原FIB、D-二聚體、Peak、ETP、lag-time、tt Peak)進(jìn)行相關(guān)分析,探討TF-MPs與高凝指標(biāo)之間相關(guān)關(guān)系。結(jié)果:1與對照組患者比較,實驗組患者的PT、APTT時間縮短,FIB、D-二聚體數(shù)值增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2凝血酶生成實驗結(jié)果顯示:實驗組患者lag-time(2.352±1.274min)短于對照組(3.582±2.330min),P0.05;實驗組患者Peak(434.97±159.28nmol/L)高于對照組Peak(354.10±144.11nmol/L),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;實驗組患者ETP nmol/l.min(2586.41±964.44)高于對照組患者(2036.00±1133.47),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05;實驗組患者tt Peak(3.383±1.699min)短于對照組患者(6.182±3.541min)具差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。3實驗組患者隨著Peak、ETP腫瘤分期的增高而升高,伴隨侵襲性的增加而升高,lag-time、tt Peak伴隨侵襲性的增加而縮短P0.05。4實驗組患者的血漿TF-MPs水平(76.69±18.89)明顯高對照組(57.58±12.97),P0.001,TF-MPs水平伴隨著腫瘤分期增高而升高P0.001,伴隨侵襲性的增加而升高P0.05。5相關(guān)分析結(jié)果顯示患者血漿中TF-MPs與PT(r=-0.328,P0.05)、APTT(r=-0.393,P0.05)、lag-time(r=-0.426,P0.05)、tt Peak(r=-0.411,P0.05)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與FIB(r=0.421,P0.05)、D-二聚體(r=0.473,P0.05)以及Peak(r=0.389,P0.05)、ETP(r=0.381,P0.05)呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論:1乳腺癌患者普遍存在亞臨床高凝狀態(tài),即未出現(xiàn)臨床癥狀的異常高凝狀態(tài)。2隨惡性腫瘤分期的增加高凝狀態(tài)傾向、血漿TF-MPs出現(xiàn)相應(yīng)升高,隨侵襲性增加,高凝狀態(tài)傾向、血漿TF-MPs出現(xiàn)相應(yīng)升高。3血漿TF-MPs水平與患者高凝狀態(tài)存在明確的正相關(guān)關(guān)系。第三部分乳腺癌細(xì)胞來源組織因子微粒促進(jìn)高凝的機制目的:明確乳腺癌細(xì)胞來源TF-MPs的促凝功能以及對其機制的探討方法:經(jīng)過PCR、Western-blot方法檢測,在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、BT549、MDA-MB-453、MCF-7四種細(xì)胞中篩選高表達(dá)TF(實驗組)、低表達(dá)TF(對照組)的細(xì)胞株進(jìn)行微粒及促凝活性檢測。1常規(guī)培養(yǎng)實驗組、對照組兩種乳腺癌細(xì)胞,培養(yǎng)成功后留取培養(yǎng)液待進(jìn)一步流式檢測。2將5×106個乳腺癌細(xì)胞懸浮于0.5ml的PBS中,經(jīng)過搖床溫育、離心等物理刺激作用使細(xì)胞發(fā)生機械破碎產(chǎn)生TF-MPs,進(jìn)一步離心得到乳腺癌細(xì)胞來源TF-MPs的PBS混懸液,對其進(jìn)行流式以及促凝功能檢測。3應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對TF-MPs的PBS混懸液及細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行定性、定量分析,設(shè)定條件為:PE標(biāo)記抗人組織因子抗體陽性、Annexin-FTIC陽性,直徑小于1μm,符合上述條件認(rèn)為是TF-MPs。測量五次取平均值,在兩組間進(jìn)行比較。4促凝功能測定:應(yīng)用一期凝固法(one-stage clotting assay)對來源于5×106兩種細(xì)胞的TF-MPs混懸液進(jìn)行促凝功能(procoagulant activity PCA)測定,比較兩組PCA差異。5促凝機制驗證:1)應(yīng)用梯度容量稀釋的方法使5管相同TF-MPs的PBS混懸液中含有不同劑量(100、50、25、12.5、0μg/ml)的組織因子單克隆抗體(Monoclonal anti-human tissue factor,a TF)、膜聯(lián)蛋白-V(Annexin-v),它們分別封閉TF-MPs表面的TF和磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS),分析不同劑量a TF、Annexin-v封閉TF和PS后PCA下降的變化。2)應(yīng)用同樣梯度容量稀釋的方法,將PBS代替a TF和Annexin-v加入待測TF-MPs混懸液中,將測得的PCA與加入a TF、Annexin-v后的PCA進(jìn)行比較進(jìn)一步明確TF和PS對PCA的影響。結(jié)果:1 PCR、Western-blot檢測顯示四種細(xì)胞株中MDA-MB-231組織因子表達(dá)水平最高,其次為MDA-MB-453、MCF-7、BT549。選擇MDA-MB-231作為實驗組,MCF-7作為對照組2在實驗組、對照組兩種細(xì)胞培養(yǎng)液檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)液檢測到符合條件的TF-MPs,12.80±1.04/μl,MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液中未檢測到TF-MPs。3經(jīng)過對MDA-MB-231與MCF-7兩種細(xì)胞搖床溫育、離心等物理刺激后,流式細(xì)胞學(xué)檢測證實上述物理刺激可以產(chǎn)生符合設(shè)定條件的TF-MPs。高表達(dá)TF的MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生的微粒(55.80±1.64/μl)明顯高于低表達(dá)組織因子的MCF-7細(xì)胞(10.40±1.14/μl)P0.01。4促凝功能測定結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞來源TF-MPs混懸液的PCA(220.84±2.20)明顯大于MCF-7細(xì)胞組來源TF-MPs混懸液的PCA(36.13±0.85)P0.01。5在MDA-MB-231細(xì)胞來源TF-MPs的PBS混懸液中加入不同劑量的a TF,PCA水平隨加入a TF濃度的增加而下降,與未加入a TF的混懸液比較具有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。當(dāng)加入TF單抗量的增加至50μg/ml后,PCA未再出現(xiàn)明顯下降P0.05,提示在a TF到達(dá)50μg/ml時,PCA被最大抑制,再增加a TF劑量對PCA無繼續(xù)影響,其結(jié)果接近PBS的PCA58.49±1.23,說明TF-MPs的促凝活性主要來源于TF。6應(yīng)用同樣梯度容量稀釋的方法,將PBS代替a TF加入待測TF-MPs的PBS混懸液中測得PCA,與加入a TF組比較,不同濃度a TF的PCA均低于不同濃度PBS的PCA,P0.05,TF在TF-MPs的促凝活性中發(fā)揮著重要作用。7在MDA-MB-231細(xì)胞來源TF-MPs的PBS混懸液中加入不同劑量Annexin-V后,PCA水平隨加入Annexin-V濃度的增加而下降,與未加入Annexin-V的TF-MPs混懸液比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異P0.05。8 Annexin-V量的增加至50μg/ml后,PCA未再出現(xiàn)繼續(xù)下降,再增加劑量對PCA無繼續(xù)影響。但與a TF不同,此時PCA活性仍高于PBS的PCA,P0.05,說明TF-MPs的PCA部分來源于PS。9應(yīng)用同樣梯度容量稀釋的方法,將PBS代替Annexin-V加入待測TF-MPs混懸液中測得PCA,與加入Annexin-V組比較,Annexin-V實驗組中不同濃度的PCA均低于PBS組不同濃度的PCA,P0.05,PS在TF-MPs的促凝活性中發(fā)揮作用。結(jié)論:1乳腺癌細(xì)胞來源的TF-MPs具有顯著的促凝活性。2 TF-MPs發(fā)揮促凝機制主要依賴于微粒表面的TF、PS結(jié)構(gòu),并且TF在促凝中起著主導(dǎo)作用,PS起輔助作用。3乳腺癌細(xì)胞可以自發(fā)向周圍介質(zhì)釋放TF-MPs。4乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生TF-MPs量的多少與細(xì)胞膜表達(dá)TF量的多少有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.33;R730.5

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本文編號：1320446