本文關鍵詞：非溶酶體途徑的基因轉染及治療研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：基因治療是利用內源性或外源性的遺傳物質來改善細胞功能、殺滅病變組織或增強機體自身保護能力�；蛑委煹牟呗灾饕腥N：物理導入、病毒載體及非病毒載體。相比前兩種導入方式,非病毒載體無基因片段包載容量限制,低毒且無免疫原性、易于大規(guī)模生產及保存。然而非病毒基因的轉染效率普遍較低,主要原因為血漿穩(wěn)定性差、溶酶體滯留、包載/釋放矛盾等,尤其是溶酶體滯留問題,導致基因在酸性環(huán)境中被大量破壞。非病毒基因載體往往利用陽離子聚合物的“質子緩沖效應”以破壞溶酶體,導致較高的細胞毒性。最近報道,有研究者通過組蛋白(H3)修飾聚乙烯亞胺,入胞后以非溶酶體途徑抵達核周,獲得了較高的轉染效率且減小了毒性。這種基于細胞內部轉運機制的非病毒載體設計的全新策略展示了很好的應用前景。本文構建了兩種非溶酶體轉運途徑的非病毒基因載體系統(tǒng)：聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及特殊FAL多肽修飾的陽離子脂質體。前者具有獨特的理化性質,能夠通過小窩蛋白介導的內吞途徑實現內在化,該入胞機制能避免傳統(tǒng)的溶酶體途徑,實現良好的基因轉染及基因治療效果；后者利用一種陽離子多肽FL修飾普通的陽離子脂質體,實現安全高效的細胞內部轉運方式。除溶酶體滯留問題,非病毒基因載體往往面臨著“包載/釋放矛盾”的問題。為了防止核酸在胞外過早釋放以及保護核酸免受酶的破壞,非病毒基因載體需要同核酸緊密結合成穩(wěn)定的顆粒。而一旦復合物抵達作用部位,過于致密的結構則不利于充分釋放核酸。光熱基因轉染(photothermal transfection)是解決這一個問題的新策略。本文以光熱吸收特性的碳納米管為骨架材料,使用三種不同分子量的聚乙烯亞胺-膽固醇(PEI25K-Chol, PEI10K-Chol及PEI1.8K-Chol)物理修飾碳納米管側壁得到三種光熱基因轉染試劑——PEI-Chol/SWNTs(PCS25K,PCS10K, PCS1.8K)復合系統(tǒng)。通過紅外光譜驗證物理修飾的成功性,透射電鏡顯微鏡、紫外可見吸收光譜及動態(tài)光散射法表征PCS復合系統(tǒng)的理化性質,瓊脂糖凝膠電泳實驗考察三種PCS與DNA的結合能力,發(fā)現PCS結合DNA的能力取決于聚乙烯亞胺的分子量,即PCS25KPCS10KPCS1.8K.三種PCS與DNA形成的復合物在體外具有明顯的光熱轉換能力,NIR光刺激可導致DNA從復合物解離而被DNaseI酶降解,未受NIR激的復合物展現出良好的抗DNaseI酶能力。使用MTT法檢測了PCS/DNA復合物對HEK293細胞、HeLa細胞的細胞毒性,發(fā)現當載體基因復合比相同時,PCS/DNA的細胞毒性略低于對應分子量的PEI/DNA.NIR刺激并未顯著改變PCS/DNA的細胞毒性。將PCS用異硫氰酸熒光素(FITC)標記,DNA用花青染料熒光Cy3標記,兩者熒光復合物用細胞流式儀及激光共聚焦考察在不同攝取抑制條件下的入胞情況,發(fā)現該復合物主要依賴小窩蛋白介導的內吞途徑。經進一步的共定位實驗發(fā)現,復合物內在化后能較大程度避免溶酶體途徑,使得DNA具有良好的穩(wěn)定性。并在近紅外激光刺激下,觀察FITC-PCS與Cy3-DNA的解離情況,再次驗證NIR光能促進PCS與DNA的解離,但該行為并未在傳統(tǒng)轉染試劑1EI25K與DNA復合物中呈現。以pEGFP-C1為報告基因,進行體外光熱轉染實驗發(fā)現,體外無激光刺激時三種PCS在HEK293中的轉染能力為：PCS25KPCS10KPCS1.8K激光刺激能提高PCS在HEK293, HeLa細胞中的綠色熒光蛋白表達水平。為了研究PCS的光熱基因治療領域的潛力,本文選擇腫瘤抑制基因pTP53質粒,利用PCS10K介導,通過細胞周期、凋亡/死亡率、線粒體膜電位、核碎片、線粒體形態(tài)及凋亡蛋白檢測,研究其對HeLa細胞的抑制能力及凋亡機制。此外,本文構建了乳腺癌移植瘤模型,通過腫瘤生長曲線、組織切片染色等評價PCS10K/pTP53復合物于體內的抑瘤效果。非溶酶體途徑的陽離子脂質體通過引入特殊FAL多肽修飾普通的陽離子脂質體。首先,使用FAL多肽修飾二硬脂�；字Ｒ掖及�-聚乙二醇(DSPE-PEG-NH2)得到產物DSPE-PEG-FAL,通過核磁共振譜、紅外光譜研究,證明FAL多肽成功連接于DSPE-PEG,選用陽離子脂質2-二油�；u丙基-3-N,N,N-三甲銨(DOTAP),中性輔助脂質二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)及DSPE-PEG-NH2同DSPE-PEG-FAL的混合物為膜材,采用薄膜分散法制備了FAL修飾的陽離子脂質體(Liposome-FAL)。以pEGFP-C1為報告基因,以]HEK293、 A549及MCF-7細胞為模型,使用熒光倒置顯微鏡觀察Liposome-FAL轉基因能力,發(fā)現含2.25%的DSPE-PEG-FAL的Liposome-FAL的轉染效率遠遠高于無修飾的普通PEG陽離子脂質體(Liposome-Non)。使用乳腺癌移植瘤模型進行體內轉染試驗,發(fā)現Liposome-FAL體內轉染效率略優(yōu)于商業(yè)化轉染試劑Lipofectamine2000,且腫瘤內亦呈現明顯的綠色熒光蛋白水平。應用pTP53質粒為模型藥物,用Liposome-FAL及Liposome-Non攜載后進行抗腫瘤研究。Liposome-FAL/pTP53復合物能顯著抑制乳腺癌腫瘤,且p53蛋白免疫組化結果顯示其表達水平高于Lipofectamine2000/pTP53組,而Liposome-Non/pTP53復合物則無明顯抑瘤作用。綜上,FAL修飾陽離子脂質體顯示了良好的基因轉染及治療能力。而基于非溶酶體途徑機制設計基因載體的策略十分具有潛力。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R450

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本文編號：1320230