發(fā)布時(shí)間：2017-12-22 16:45

  本文關(guān)鍵詞：非溶酶體途徑的基因轉(zhuǎn)染及治療研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：基因治療是利用內(nèi)源性或外源性的遺傳物質(zhì)來改善細(xì)胞功能、殺滅病變組織或增強(qiáng)機(jī)體自身保護(hù)能力�；蛑委煹牟呗灾饕腥N：物理導(dǎo)入、病毒載體及非病毒載體。相比前兩種導(dǎo)入方式,非病毒載體無基因片段包載容量限制,低毒且無免疫原性、易于大規(guī)模生產(chǎn)及保存。然而非病毒基因的轉(zhuǎn)染效率普遍較低,主要原因?yàn)檠獫{穩(wěn)定性差、溶酶體滯留、包載/釋放矛盾等,尤其是溶酶體滯留問題,導(dǎo)致基因在酸性環(huán)境中被大量破壞。非病毒基因載體往往利用陽離子聚合物的“質(zhì)子緩沖效應(yīng)”以破壞溶酶體,導(dǎo)致較高的細(xì)胞毒性。最近報(bào)道,有研究者通過組蛋白(H3)修飾聚乙烯亞胺,入胞后以非溶酶體途徑抵達(dá)核周,獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率且減小了毒性。這種基于細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的非病毒載體設(shè)計(jì)的全新策略展示了很好的應(yīng)用前景。本文構(gòu)建了兩種非溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的非病毒基因載體系統(tǒng)：聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及特殊FAL多肽修飾的陽離子脂質(zhì)體。前者具有獨(dú)特的理化性質(zhì),能夠通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)內(nèi)在化,該入胞機(jī)制能避免傳統(tǒng)的溶酶體途徑,實(shí)現(xiàn)良好的基因轉(zhuǎn)染及基因治療效果；后者利用一種陽離子多肽FL修飾普通的陽離子脂質(zhì)體,實(shí)現(xiàn)安全高效的細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)方式。除溶酶體滯留問題,非病毒基因載體往往面臨著“包載/釋放矛盾”的問題。為了防止核酸在胞外過早釋放以及保護(hù)核酸免受酶的破壞,非病毒基因載體需要同核酸緊密結(jié)合成穩(wěn)定的顆粒。而一旦復(fù)合物抵達(dá)作用部位,過于致密的結(jié)構(gòu)則不利于充分釋放核酸。光熱基因轉(zhuǎn)染(photothermal transfection)是解決這一個(gè)問題的新策略。本文以光熱吸收特性的碳納米管為骨架材料,使用三種不同分子量的聚乙烯亞胺-膽固醇(PEI25K-Chol, PEI10K-Chol及PEI1.8K-Chol)物理修飾碳納米管側(cè)壁得到三種光熱基因轉(zhuǎn)染試劑——PEI-Chol/SWNTs(PCS25K,PCS10K, PCS1.8K)復(fù)合系統(tǒng)。通過紅外光譜驗(yàn)證物理修飾的成功性,透射電鏡顯微鏡、紫外可見吸收光譜及動態(tài)光散射法表征PCS復(fù)合系統(tǒng)的理化性質(zhì),瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)考察三種PCS與DNA的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)PCS結(jié)合DNA的能力取決于聚乙烯亞胺的分子量,即PCS25KPCS10KPCS1.8K.三種PCS與DNA形成的復(fù)合物在體外具有明顯的光熱轉(zhuǎn)換能力,NIR光刺激可導(dǎo)致DNA從復(fù)合物解離而被DNaseI酶降解,未受NIR激的復(fù)合物展現(xiàn)出良好的抗DNaseI酶能力。使用MTT法檢測了PCS/DNA復(fù)合物對HEK293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)當(dāng)載體基因復(fù)合比相同時(shí),PCS/DNA的細(xì)胞毒性略低于對應(yīng)分子量的PEI/DNA.NIR刺激并未顯著改變PCS/DNA的細(xì)胞毒性。將PCS用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記,DNA用花青染料熒光Cy3標(biāo)記,兩者熒光復(fù)合物用細(xì)胞流式儀及激光共聚焦考察在不同攝取抑制條件下的入胞情況,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物主要依賴小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。經(jīng)進(jìn)一步的共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),復(fù)合物內(nèi)在化后能較大程度避免溶酶體途徑,使得DNA具有良好的穩(wěn)定性。并在近紅外激光刺激下,觀察FITC-PCS與Cy3-DNA的解離情況,再次驗(yàn)證NIR光能促進(jìn)PCS與DNA的解離,但該行為并未在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑1EI25K與DNA復(fù)合物中呈現(xiàn)。以pEGFP-C1為報(bào)告基因,進(jìn)行體外光熱轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),體外無激光刺激時(shí)三種PCS在HEK293中的轉(zhuǎn)染能力為：PCS25KPCS10KPCS1.8K激光刺激能提高PCS在HEK293, HeLa細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá)水平。為了研究PCS的光熱基因治療領(lǐng)域的潛力,本文選擇腫瘤抑制基因pTP53質(zhì)粒,利用PCS10K介導(dǎo),通過細(xì)胞周期、凋亡/死亡率、線粒體膜電位、核碎片、線粒體形態(tài)及凋亡蛋白檢測,研究其對HeLa細(xì)胞的抑制能力及凋亡機(jī)制。此外,本文構(gòu)建了乳腺癌移植瘤模型,通過腫瘤生長曲線、組織切片染色等評價(jià)PCS10K/pTP53復(fù)合物于體內(nèi)的抑瘤效果。非溶酶體途徑的陽離子脂質(zhì)體通過引入特殊FAL多肽修飾普通的陽離子脂質(zhì)體。首先,使用FAL多肽修飾二硬脂�；字Ｒ掖及�-聚乙二醇(DSPE-PEG-NH2)得到產(chǎn)物DSPE-PEG-FAL,通過核磁共振譜、紅外光譜研究,證明FAL多肽成功連接于DSPE-PEG,選用陽離子脂質(zhì)2-二油�；u丙基-3-N,N,N-三甲銨(DOTAP),中性輔助脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)及DSPE-PEG-NH2同DSPE-PEG-FAL的混合物為膜材,采用薄膜分散法制備了FAL修飾的陽離子脂質(zhì)體(Liposome-FAL)。以pEGFP-C1為報(bào)告基因,以]HEK293、 A549及MCF-7細(xì)胞為模型,使用熒光倒置顯微鏡觀察Liposome-FAL轉(zhuǎn)基因能力,發(fā)現(xiàn)含2.25%的DSPE-PEG-FAL的Liposome-FAL的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無修飾的普通PEG陽離子脂質(zhì)體(Liposome-Non)。使用乳腺癌移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Liposome-FAL體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率略優(yōu)于商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000,且腫瘤內(nèi)亦呈現(xiàn)明顯的綠色熒光蛋白水平。應(yīng)用pTP53質(zhì)粒為模型藥物,用Liposome-FAL及Liposome-Non攜載后進(jìn)行抗腫瘤研究。Liposome-FAL/pTP53復(fù)合物能顯著抑制乳腺癌腫瘤,且p53蛋白免疫組化結(jié)果顯示其表達(dá)水平高于Lipofectamine2000/pTP53組,而Liposome-Non/pTP53復(fù)合物則無明顯抑瘤作用。綜上,FAL修飾陽離子脂質(zhì)體顯示了良好的基因轉(zhuǎn)染及治療能力。而基于非溶酶體途徑機(jī)制設(shè)計(jì)基因載體的策略十分具有潛力。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R450

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本文編號：1320230