本文關(guān)鍵詞：乳頭溢液及血液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA篩選驗證及其功能預(yù)測的研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一,其早期診斷是重要的臨床課題。MicroRNA(miRNA)是一種小的、非編碼單鏈RNA,它在生物體內(nèi)基本的生理過程、病理過程中發(fā)揮了重要的作用。很多研究結(jié)果證明,miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),可以作為惡性腫瘤的生物標(biāo)記物。miRNA被證明存在于多種體液中并保持相對穩(wěn)定,這為其成為腫瘤標(biāo)記物提供了先決條件。目前關(guān)于乳腺癌患者的乳頭溢液及血液中miRNA作為腫瘤標(biāo)記物的領(lǐng)域尚需探索。第一部分乳頭溢液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA的篩選、驗證與功能預(yù)測目的:1.證實乳頭溢液中的miRNA的存在。2.篩選并驗證乳腺癌與乳腺良性腫瘤乳頭溢液中miRNA的差異表達(dá)。3.驗證生理性乳頭溢液——乳汁中miRNA的存在及其穩(wěn)定性。4.運用生物信息學(xué)方法分析差異表達(dá)的miRNA的潛在作用機(jī)制。材料與方法:1.收集3例乳腺癌患者、3例乳腺良性腫瘤患者的乳頭溢液,通過miRNA芯片篩選差異表達(dá)miRNA。2.在8例乳腺癌患者、13例乳腺良性腫瘤患者的乳頭溢液中,通過實時定量PCR驗證差異表達(dá)的miRNA。3.2例產(chǎn)婦乳汁于4℃放置0-72小時,使用實時定量PCR檢測miRNA表達(dá)水平隨時間的變化。4.使用Targetscan及miRDB軟件預(yù)測miRNA的靶基因,然后進(jìn)行GO分析、KEGG pathway富集、蛋白互作分析。結(jié)果:1.芯片結(jié)果提示:相比于乳腺良性腫瘤的乳頭溢液,3個miRNA(miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646)在乳腺癌的乳頭溢液中表達(dá)上調(diào),3個miRNA(miR-4732-5p、miR-4687-3p、miR-S1-5p)表達(dá)下調(diào)。2.經(jīng)過實時定量PCR驗證,證實在乳腺癌的乳頭溢液中,miR-4484、miR-K12-5-5p、miR-3646 表達(dá)上調(diào),而 miR-4732-5p 表達(dá)下調(diào)。3.乳汁在置于4℃的72小時內(nèi),其miR-3646、miR-4732-5p的表達(dá)水平相對穩(wěn)定。4.許多腫瘤相關(guān)基因如 ADIPOQ、CPEB1、DNAJB4、EIF4E、APP 及 BCLAF1等是miR-4484、miR-3646、miR-4732-5p的潛在靶基因。通路富集分析發(fā)現(xiàn),miR-3646的潛在靶基因與Rap1、TGF-β通路相關(guān),miR-4484的潛在靶基因可能參與ErbB通路、雌激素通路、點狀粘附通路,而miR-4732-5p的潛在靶基因可富集到癌癥蛋白聚糖通路。蛋白互作分析提示,這些miRNA的潛在靶基因存在相互作用的可能。轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控分析發(fā)現(xiàn),這些潛在靶基因受到ATF、CREB、C/EBPalpha、c-fos、c-Jun等重要腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。結(jié)論:在乳腺癌患者的乳頭溢液中證實miR-4484、miR-K12-5-5p及miR-3646的表達(dá)上調(diào),miR-4732-5p的表達(dá)下調(diào)。miR-3646、miR-4732-5p在乳汁中表達(dá)穩(wěn)定性較好。生物信息學(xué)分析表明,miRNA可能通過調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白參與多個癌癥相關(guān)通路。本研究為miRNA成為乳頭溢液中乳腺癌腫瘤標(biāo)記物提供了理論基礎(chǔ)。第二部分血液中乳腺癌相關(guān)MicroRNA的篩選、驗證與功能預(yù)測目的:1.篩選并驗證乳腺癌患者與健康對照者全血中差異表達(dá)的miRNA。2.運用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的miRNA可能的作用機(jī)制及預(yù)后價值。材料與方法:1.收集6例乳腺癌患者、6例健康對照的全血樣品,通過miRNA芯片篩選差異表達(dá)miRNA。2.在15例乳腺癌患者、13例健康對照的全血樣品中,通過實時定量PCR驗證差異表達(dá)的miRNA。3.miRWalk數(shù)據(jù)庫用于預(yù)測miRNA靶基因,并使用DAVID工具尋找潛在靶基因顯著富集的通路。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析miRNA及其潛在靶基因在乳腺癌中的預(yù)后價值。結(jié)果:1.通過miRNA芯片共發(fā)現(xiàn)171個差異表達(dá)的miRNA,乳腺癌組與健康對照組相比有169個上調(diào),2個下調(diào)。2.通過實時定量PCR證實了 5 個miRNA(miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-374b-5p和miR-942-5p)在乳腺癌中上調(diào)。ROC曲線分析提示,這5個miRNA的表達(dá)可較好地區(qū)分乳腺癌患者及健康對照者。3.miR-30b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-374b-5p 和 miR-942-5p 在早期乳腺癌患者全血中就已發(fā)生上調(diào)。4.共有855個基因被預(yù)測為5個miRNA的靶基因,其中ONECUT2是5個miRNA的共同潛在靶基因。公開數(shù)據(jù)的分析顯示,這些miRNA和潛在靶基因與乳腺癌患者的生存相關(guān)。此外,這5個miRNA的潛在靶基因在許多癌癥相關(guān)通路中顯著富集,包括"MicroRNAs in cancer"通路,"Pathways in cancer"通路,FoxO信號通路,Ras信號通路,Rap1信號通路,MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路等。結(jié)論:本研究的數(shù)據(jù)支持 5 個 miRNA(miR-30b-5p,miR-96-5p,miR-182-5p,miR-374b-5p和miR-942-5p)作為全血中檢測乳腺癌的新型腫瘤標(biāo)記物的潛力,并表明它們可能參與乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳路嘉;葉長生;黃仲曦;李欣;姚廣裕;劉民鋒;胡曉磊;董建宇;郭昭澤;;大樣本芯片數(shù)據(jù)分析亞洲人乳腺癌差異表達(dá)基因及可能信號通路[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2014年06期

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本文編號：1320037