本文關(guān)鍵詞：自噬在主動(dòng)脈瓣鈣化和ROS介導(dǎo)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景鈣化性主動(dòng)脈瓣膜狹窄(Calcific aortic valve stenosis,CAVS)的發(fā)病率位居心血管疾病中的第三位,表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣的纖維化、鈣化以及瓣葉交界處的融合,從而造成瓣口面積的狹窄。由于其具體的發(fā)病機(jī)制尚未明了,目前只能通過置換人工瓣膜的方式進(jìn)行治療�；A(chǔ)研究的進(jìn)展提示,主動(dòng)脈瓣鈣化不僅是一個(gè)細(xì)胞萎縮凋亡導(dǎo)致鈣鹽被動(dòng)沉積的過程,還涉及瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成纖維母細(xì)胞和類成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞是維持主動(dòng)脈瓣正常形態(tài)和生理功能的主要執(zhí)行者,其體外鈣化模型作為一種有效工具被廣泛應(yīng)用于CAVS的機(jī)制和藥物研究中。氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是氧化還原系統(tǒng)失衡后活性氧簇(ROS)在細(xì)胞內(nèi)堆積并造成組織損傷的過程。近年研究發(fā)現(xiàn),ROS水平在鈣化的主動(dòng)脈瓣中升高,與抗氧化酶的減少有關(guān),并能引起瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的DNA損傷和早期活化。越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激/ROS與細(xì)胞自噬之間存在著緊密而復(fù)雜的聯(lián)系。自噬(Autophagy)是一種對(duì)細(xì)胞成份進(jìn)行自我消化并實(shí)現(xiàn)再循環(huán)利用的現(xiàn)象,在生物體內(nèi)廣泛存在且在進(jìn)化中高度保守,是近十年來基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。ROS被認(rèn)為能對(duì)自噬進(jìn)行正向或負(fù)向的調(diào)節(jié),而自噬也能通過降解氧化還原相關(guān)的蛋白和細(xì)胞器影響ROS。然而,自噬現(xiàn)象并沒有在CAVS中得到深入、可靠的研究,而氧化應(yīng)激與自噬的關(guān)系在主動(dòng)脈瓣鈣化領(lǐng)域中還未見報(bào)道。目的(一)觀察自噬現(xiàn)象對(duì)鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄及瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外鈣化過程中發(fā)生的情況。(二)明確自噬對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化及其中伴隨的細(xì)胞損傷/凋亡的影響和具體機(jī)制。(三)探索氧化應(yīng)激與自噬在主動(dòng)脈瓣鈣化過程中的相互作用及具體機(jī)制。方法(一)瓣膜標(biāo)本及細(xì)胞培養(yǎng)1、臨床標(biāo)本的收集與處理:收集在我科行瓣膜手術(shù)的CAVS患者的鈣化性主動(dòng)脈瓣標(biāo)本以及纖維化增厚的主動(dòng)脈瓣,以尸檢或心臟移植患者的瓣膜為正常對(duì)照組,將組織標(biāo)本迅速固定于福爾馬林或凍存于液氮中以待檢測。2、豬來源主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(PAVICs)的分離:將豬主動(dòng)脈瓣切除后,置于Ⅰ型膠原酶中37℃消化10分鐘,使用滅菌棉簽將表面的而瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞擦除,再置于Ⅱ型膠原酶中37℃震蕩消化2小時(shí),過濾、離心后重懸。3、PAVICs的鑒定:使用免疫熒光法對(duì)PAVICs進(jìn)行間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的檢測。4、PAVICs的培養(yǎng):使用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)使用3-6代細(xì)胞,每2-4天換液。(二)體外成骨誘導(dǎo)及鈣化相關(guān)的檢測1、體外鈣化模型的建立:使用配方分別為2m M磷酸二氫鈉、50μg/ml抗壞血酸、107M胰島素和10m Mβ-磷酸甘油鈉、50μg/ml抗壞血酸、100n M地塞米松的兩種鈣化培養(yǎng)基(OIM-1/2)誘導(dǎo)PAVICs成骨,發(fā)生鈣鹽沉積所需的培養(yǎng)時(shí)間分別為7天和21天。2、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向類骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的檢測:通過免疫印跡法檢測α-SMA和成骨標(biāo)志物RUNX2、OPN的表達(dá);使用BCIP/NBT堿性磷酸酶染色法檢測ALP的表達(dá)。3、鈣鹽沉積的檢測:配制p H=4.3的1%茜素紅S染色液對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行染色。(三)自噬的檢測及干預(yù)方法1、形態(tài)學(xué)檢測:使用透射電子顯微鏡對(duì)瓣膜組織標(biāo)本中自噬體、自噬溶酶體等自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接觀察。2、組織中自噬水平的分析:通過免疫組織化學(xué)、免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7的表達(dá)水平;使用免疫熒光雙標(biāo)檢測BECN1與Vimentin的共定位。3、PAVICs中自噬體的形成及相關(guān)通路的檢測:配合巴伐洛霉素A1,通過免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ的轉(zhuǎn)化比、自噬相關(guān)蛋白、p-AKT(ser473)和p-P70S6K(Thr389)的表達(dá)。4、PAVICs中自噬流的發(fā)生:免疫印跡法檢測P62的降解;GFP-m RFP-LC3雙熒光示蹤系統(tǒng)檢測檢測自噬體的形成以及自噬體和溶酶體的結(jié)合。5、自噬的干預(yù):使用雷帕霉素增強(qiáng)自噬;渥曼青霉素和氯喹抑制自噬;構(gòu)建自噬關(guān)鍵基因BECN1的干擾腺病毒,特異性地抑制自噬。(四)氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)、干預(yù)及細(xì)胞損傷相關(guān)的檢測1、氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建:使用含100~1000μM過氧化氫的完全培養(yǎng)基刺激PAVICs 0.5小時(shí)~14天。2、活性氧水平的檢測:使用2',7'-DCFH綠色熒光探針標(biāo)記活性氧,通過熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀定量分析。3、氧化應(yīng)激的干預(yù):應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸清除PAVICs內(nèi)的活性氧。4、細(xì)胞毒性分析:使用CCK-8法測定細(xì)胞的活性;使用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞膜的損傷。5、細(xì)胞凋亡的干預(yù)和檢測:應(yīng)用Caspase通路抑制劑Z-Vad-FMK抑制細(xì)胞凋亡;使用Annexin V/PI雙標(biāo)記PAVICs,并通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析早/晚期凋亡的比例;通過免疫印跡法檢測Caspase3、PARP的剪切體/前體比例反應(yīng)細(xì)胞凋亡中Caspase途徑激活的程度。結(jié)果(一)鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄中自噬水平的檢測。在透射電鏡下可以觀察到纖維化主動(dòng)脈瓣中有較多的自噬體,鈣化的主動(dòng)脈瓣細(xì)胞中存在大量的自噬體和自噬溶酶體,而正常的瓣膜中只能找到少量的自噬前體。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示自噬相關(guān)蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7在纖維化和鈣化的瓣膜中的陽性表達(dá)高于正常瓣膜;免疫印跡半定量分析提示在CAVS標(biāo)本中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例顯著升高,BECN1和ATG5都有不同程度的高表達(dá),而ATG7在三組之中未見明顯差異。免疫熒光雙標(biāo)記的結(jié)果表明自噬關(guān)鍵基因BECN1在Vimentin陽性的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)了強(qiáng)陽性,證明在纖維化、鈣化的主動(dòng)脈瓣中,瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的自噬水平升高。(二)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外鈣化模型中自噬的水平及功能研究。經(jīng)免疫熒光鑒定后,使用改良的膠原酶兩步消化法分離的豬來源主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(PAVICs)未受內(nèi)皮細(xì)胞的污染。在兩種鈣化培養(yǎng)基(OIM-1/2)培養(yǎng)PAVICs的過程中,OPN和RUNX2表達(dá)明顯升高,α-SMA降低,ALP染色陽性,提示PAVICs由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為類骨母細(xì)胞;茜素紅染色顯示OIM-1/2都能使體外培養(yǎng)的PAVICs出現(xiàn)大量的鈣鹽沉積。使用OIM-1/2短期(24小時(shí))刺激PAVICs后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加,P62減少,巴伐洛霉素進(jìn)行干預(yù)后OIM-1/2中PAVICs的LC3-Ⅱ相對(duì)于對(duì)照組仍然增加,提示了自噬的發(fā)生;通過GFP-m RFP-LC3示蹤系統(tǒng)也直觀的觀察到了自噬體和溶酶體的結(jié)合;而在OIM-1/2長期(4~21天)的培養(yǎng)過程中,BECN1、ATG5、ATG7的表達(dá)均有不同程度的升高。當(dāng)使用自噬藥物對(duì)體外鈣化模型進(jìn)行干預(yù)時(shí),誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠顯著地緩解鈣鹽沉積,而抑制劑渥曼青霉素和BECN1干擾腺病毒加重了鈣化程度;免疫印跡分析顯示雷帕霉素干預(yù)后,PAVICs在OIM-1/2中OPN、RUNX2表達(dá)減少,α-SMA表達(dá)水平恢復(fù),ALP染色陽性強(qiáng)度減弱,而渥曼青霉素和sh BENC1的作用與之相反,提示自噬能夠通過延遲PAVICs向類骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以緩解主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)生。另外,在鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的中途應(yīng)用雷帕霉素也能減輕最終的鈣化。(三)自噬在主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中的水平和作用。2',7'-DCFH-DA探針標(biāo)記和免疫印跡結(jié)果分別顯示體外鈣化模型中PAVICs內(nèi)的活性氧水平升高并發(fā)生了Caspase途徑依賴的凋亡,使用N-乙酰半胱氨酸清除ROS后行流式檢測發(fā)現(xiàn)鈣化培養(yǎng)基中PAVICs的凋亡減少,而N-乙酰半胱氨酸(NAC)和凋亡抑制劑Z-Vad-FMK都能夠明顯抑制PAVICs的鈣化程度,揭示了氧化應(yīng)激及其引發(fā)的細(xì)胞凋亡是主動(dòng)脈瓣鈣化的重要機(jī)制。通過對(duì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及P62的檢測發(fā)現(xiàn)自噬在PAVICs氧化應(yīng)激模型中的發(fā)生呈濃度依賴式,而NAC能抑制自噬的發(fā)生。不同時(shí)間點(diǎn)(0.5~12小時(shí))的檢測提示過氧化氫誘導(dǎo)PAVICs時(shí)通過PI3K-AKT-m TOR通路激活自噬。結(jié)合巴伐洛霉素A1的干預(yù)和GFP-m RFP-LC3示蹤系統(tǒng),可以觀察到氧化應(yīng)激模型中自噬體的形成和完整自噬流的發(fā)生。NAC在體外鈣化模型中也能抑制自噬,提示主動(dòng)脈瓣鈣化過程中的自噬現(xiàn)象至少部分由氧化應(yīng)激引起。在長期的氧化應(yīng)激模型中,BECN1、ATG5、ATG7在第7天時(shí)表達(dá)升高,而在14天時(shí)表達(dá)減少。細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示Z-Vad-FMK能顯著提高PAVICs在250~750μM過氧化氫下的存活率,提示凋亡是細(xì)胞在氧化應(yīng)激模型中發(fā)生死亡的主要方式。CCK8和LDH細(xì)胞損傷檢測顯示,使用自噬藥物進(jìn)行干預(yù)后,雷帕霉素能在不同時(shí)間點(diǎn)、不同過氧化氫濃度下提高細(xì)胞活性、降低細(xì)胞的損傷,而渥曼青霉素和氯喹會(huì)加重其損傷和死亡。隨后的凋亡檢測也得出一致的結(jié)果,增強(qiáng)自噬能夠顯著緩解PAVICs的細(xì)胞凋亡和Caspase途徑的激活,而抑制自噬后有著相反的影響。最后通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)2',7'-DCFH-DA標(biāo)記的各處理組進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn),自噬是通過清除細(xì)胞內(nèi)過度堆積的活性氧而發(fā)揮其對(duì)PAVICs的保護(hù)作用的。結(jié)論氧化應(yīng)激在主動(dòng)脈瓣鈣化的過程引起了瓣膜間質(zhì)細(xì)胞高水平的自噬現(xiàn)象,自噬不僅能通過清除過量的ROS減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞損傷/凋亡,還能在體外鈣化模型中抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向類骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化從而緩解其鈣化程度。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R542.52

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本文編號(hào)：1319780