發(fā)布時(shí)間：2017-12-15 20:00

  本文關(guān)鍵詞：抗EV71病毒MAPK信號(hào)通路抑制劑的篩選及抗病毒作用的研究

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【摘要】：EV71(腸道病毒71型,Enterovirus 71)是手足口病的主要病原體之一,通常感染嬰幼兒,對(duì)其生命健康具有較大的危害。盡管絕大多數(shù)情況下EV71感染所引發(fā)的疾病具有可自愈的特點(diǎn),但發(fā)生重癥感染時(shí),EV71能夠激活患兒體內(nèi)的炎癥因子風(fēng)暴,導(dǎo)致腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、無菌性腦膜炎等其他致命性嚴(yán)重疾病的發(fā)生。目前,臨床上還沒有開發(fā)出針對(duì)重癥感染的特效治療藥物。EV71的感染和復(fù)制需要MAPK(絲裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)信號(hào)通路的激活,尤其是p38-MAPK信號(hào)通路,該通路對(duì)于EV71復(fù)制具有重要作用。MAPK信號(hào)通路小分子抑制劑具有出色的抗炎作用,在臨床試驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用于多種炎性疾病的治療�？紤]到EV71重癥感染引發(fā)的炎癥疾病,MAPK信號(hào)通路抑制藥物可能能在應(yīng)對(duì)EV71感染方面發(fā)揮抗病毒作用。本研究旨在篩選出具有抗EV71病毒效果的MAPK信號(hào)通路小分子抑制劑,在體內(nèi)外評(píng)價(jià)藥物的抗病毒作用,并探索藥物的抗病毒機(jī)制。首先對(duì)包含有65種小分子抑制劑的MAPK化合物庫(kù)進(jìn)行篩選。病毒感染后的RNA拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明多種MAPK信號(hào)通路抑制劑表現(xiàn)出抑制EV71病毒復(fù)制的作用。其中,AS602801、PD169316、BRAF inhibitor、GW5074和TAK-632均能將EV71外殼蛋白VP1的RNA拷貝數(shù)抑制為對(duì)照的10%以下。p38抑制劑PD169316展現(xiàn)出了顯著的抗病毒效應(yīng)(抑制后病毒拷貝數(shù)僅為對(duì)照的2%)。PD169316與研究中普遍使用的p38抑制劑SB203580有著相似的化合物結(jié)構(gòu),然而,PD169316抑制EV71病毒復(fù)制的效果要顯著優(yōu)于SB203580。EV71感染24h后,5μM、10μM、20μM的PD169316能將EV71 VP1 RNA拷貝數(shù)抑制為對(duì)照的11.13%、13.65%和0.2%,而相應(yīng)濃度的SB203580抑制的結(jié)果僅為65%、70%和48%。同時(shí),EV71 VP1的蛋白水平也顯著下調(diào)。EV71感染低表達(dá)p38α的HeLa細(xì)胞時(shí),復(fù)制水平顯著低于感染正常HeLa細(xì)胞。此外,細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明20μM的PD169316對(duì)RD細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒效應(yīng)。為了考察這些小分子抑制劑在動(dòng)物模型中的抗EV71病毒效果,建立了EV71攻毒致死乳鼠模型。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EV71 GDV103株攻毒1日齡昆明乳鼠和3周齡NOD-SCID(非肥胖糖尿病-重癥聯(lián)合免疫缺陷,non-obese diabetic severe combined immunodeficient)免疫缺陷小鼠時(shí),都沒有表現(xiàn)出明顯臨床病癥,因此使用EV71 MA鼠適應(yīng)株進(jìn)行抑制劑抗病毒作用的評(píng)價(jià)。EV71 MA感染乳鼠后引發(fā)的主要癥狀是四肢麻痹,癥狀嚴(yán)重時(shí)可致死。骨骼肌組織是EV71 MA感染后主要富集的區(qū)域。通過在乳鼠體內(nèi)連續(xù)傳代的方式增強(qiáng)該病毒株的毒力后,采用7日齡昆明乳鼠作為EV71 MA攻毒動(dòng)物模型。EV71 MA以106 pfu/只的劑量顱內(nèi)感染昆明乳鼠后,使用篩選出的抑制劑以1mg/kg的劑量每天進(jìn)行肌肉注射。生存曲線的結(jié)果表明所有藥物組中只有PD169316治療的乳鼠存活率要高于DMSO(二甲基亞砜,dimethyl sulfoxide)對(duì)照組。PD169316治療組乳鼠的存活率達(dá)到70%,而DMSO對(duì)照組的存活率僅有40%。PD169316組的乳鼠其死亡時(shí)間明顯晚于對(duì)照。臨床評(píng)分結(jié)果顯示,對(duì)照組的乳鼠在感染后第5天普遍出現(xiàn)單肢麻痹的輕微病癥,感染后第9天達(dá)到發(fā)病高峰,主要表現(xiàn)為四肢麻痹和死亡;而PD169316治療組的乳鼠在感染后第9天普遍出現(xiàn)雙肢麻痹癥狀。感染后11天,PD169316治療乳鼠的病癥有所恢復(fù),評(píng)分結(jié)果顯著優(yōu)于DMSO對(duì)照組。除了生存曲線和臨床評(píng)分的表現(xiàn)外,還在其他方面評(píng)價(jià)了PD169316的體內(nèi)抗病毒效果。通過檢測(cè)組織中的病毒RNA水平、病毒滴度及病毒抗原水平,結(jié)果顯示PD169316顯著降低了EV71在乳鼠骨骼肌中的復(fù)制水平。通過HE(蘇木精-伊紅,Hematoxylin and Eosin)染色對(duì)組織病理情況進(jìn)行檢查,結(jié)果表明,DMSO組乳鼠的腦部存在片狀出血的現(xiàn)象,PD169316組乳鼠腦部則沒有病理改變。DMSO組乳鼠腸組織中有明顯的粘膜下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn),而PD169316組則沒有觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)。DMSO組乳鼠骨骼肌組織中可以觀察到明顯變性、水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分區(qū)域可見壞死改變,且病變分布彌漫,而PD169316組中炎性浸潤(rùn)和壞死癥狀都得到了有效的緩解。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳鼠血清中炎癥因子的變化情況,結(jié)果顯示,EV71感染后第5天,PD169316組乳鼠血清中TNF-α(腫瘤壞死因子α,tumor necrosis factor-α)和MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白-1,monocyte chemotactic protein 1)的水平顯著低于DMSO對(duì)照組。綜上所述,PD169316能夠有效地抑制EV71在乳鼠體內(nèi)的復(fù)制,降低炎癥因子的分泌水平。通過進(jìn)一步探索PD169316的抗病毒機(jī)制,發(fā)現(xiàn)EV71的復(fù)制是p38分子激活所必須的。EV71的單個(gè)蛋白,包括4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)不能激活p38分子。β-丙內(nèi)酯滅活處理的EV71也不能激活p38-MAPK。同時(shí),病毒復(fù)制是EV71誘導(dǎo)的caspase-3細(xì)胞凋亡所必須的。而流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測(cè)結(jié)果均表明,PD169316可顯著抑制EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,且該抑制作用具有明顯的劑量依賴效應(yīng),乳鼠骨骼肌的免疫組化實(shí)驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)論。STAT1(signal transducers and activators of transcription 1,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1)的磷酸化是細(xì)胞凋亡中的重要環(huán)節(jié),PD169316可抑制STAT1Ser727磷酸化和后續(xù)的細(xì)胞凋亡。使用si RNA敲低STAT1蛋白表達(dá),進(jìn)而降低STAT1Ser727磷酸化水平后,發(fā)現(xiàn)caspase-3、caspase-8和caspase-9的剪切水平都明顯下調(diào)。這些結(jié)果說明p38/p-STAT1Ser727信號(hào)通路參與了對(duì)EV71誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控工作。為了說明PD169316是否通過降低細(xì)胞凋亡水平來抑制EV71復(fù)制,使用caspase-3特異性的抑制劑DEVD-CHO對(duì)caspase-3蛋白的激活進(jìn)行抑制。結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞凋亡被抑制后,EV71的復(fù)制水平并沒有下調(diào)。這說明PD169316的抗病毒作用不依賴于caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究篩選到的p38 MAPK抑制劑PD169316具有顯著的抗EV71病毒活性,并在細(xì)胞水平和乳鼠模型中驗(yàn)證了其抗病毒效果。EV71復(fù)制過程激活p38-MAPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的發(fā)生,p38/STAT1Ser727信號(hào)通路可能參與調(diào)控該過程。Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受抑制不影響EV71的復(fù)制。本工作為EV71治療藥物的研發(fā)提供了一種新選擇。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373.2

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本文編號(hào)：1293218