本文關(guān)鍵詞：丹紅注射液抗腦缺血作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景腦卒中,屬于中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇,具有三高(高發(fā)病率、高致殘率、高致死率)特點(diǎn)。根據(jù)病因不同可分為缺血性與出血性,在我國(guó)以缺血性腦卒中為主,提高中風(fēng)治療與預(yù)防水平,降低“三高”是其當(dāng)務(wù)之急,也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。缺血性腦卒中病理過程是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),其具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制。中醫(yī)認(rèn)為,腦卒中之證有風(fēng)、火、痰、瘀、虛之別,但瘀阻腦絡(luò)是貫穿中風(fēng)病始終的病理核心,故中醫(yī)常用活血化瘀法治療缺血性腦卒中。研究顯示,活血化瘀方可改善缺血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初始即缺血區(qū)的血液供應(yīng),但在臨床上缺血性腦卒中治療目標(biāo)不僅在于對(duì)缺血區(qū)血液供應(yīng)的改善,同時(shí)也要阻斷腦缺血后“瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)”分子鏈。揭示活血化瘀方在腦缺血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用及抗腦缺血分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,不僅有助于中醫(yī)活血化瘀法科學(xué)內(nèi)涵的闡釋,亦為活血化瘀方在臨床防治腦缺血提供了理論依據(jù)。基于此,本研究以活血化瘀代表方-丹紅方(丹紅注射液)作為切入點(diǎn),從腦缺血病理反應(yīng)不同環(huán)節(jié)結(jié)合蛋白質(zhì)及代謝組學(xué)技術(shù),綜合闡釋丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制,以期從分子層面闡釋活血化瘀方防治腦缺血作用機(jī)理。該研究方向獲得了國(guó)家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目的資助(No.81330086),本課題屬于該項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容之一。研究?jī)?nèi)容本研究分為兩個(gè)方面,文獻(xiàn)綜述與實(shí)驗(yàn)研究。文獻(xiàn)綜述:系統(tǒng)回顧了腦缺血病理機(jī)制及與其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并對(duì)丹紅注射液臨床療效、藥理作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了梳理,以期為后期實(shí)驗(yàn)研究提供方向和參考。實(shí)驗(yàn)研究:本研究在對(duì)丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)以及丹紅注射液抗腦缺血“量-效”,“時(shí)-效”研究的基礎(chǔ)上,從腦缺血病理過程中相關(guān)環(huán)節(jié)考察丹紅注射液抗腦缺血的作用,并采用組學(xué)技術(shù),從蛋白質(zhì)及氨基酸代謝層面,綜合闡釋丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)理,以期為腦缺血現(xiàn)代研究及活血化瘀方防治腦缺血提供深層次認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容共包括三個(gè)部分:1.基于數(shù)據(jù)挖掘的丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)研究:基于《中醫(yī)方劑大辭典》及《中藥成方制劑》數(shù)據(jù)庫(kù),應(yīng)用“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)”系統(tǒng),提取含丹參、紅花藥對(duì)的方劑,運(yùn)用軟件的關(guān)聯(lián)規(guī)則,改進(jìn)的互信息法等數(shù)據(jù)挖掘方法,客觀地分析丹參、紅花藥對(duì)的組方規(guī)律和特點(diǎn),以期更好地理解丹紅注射液配伍的原理和適應(yīng)證,為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。2.基于腦缺血病理反應(yīng)相關(guān)環(huán)節(jié)的丹紅注射液抗腦缺血作用研究:通過不同劑量丹紅注射液干預(yù)大鼠腦缺血模型,在篩選出最佳劑量的基礎(chǔ)上,觀察丹紅注射液對(duì)12h、24h腦缺血的干預(yù)作用,并從神經(jīng)元凋亡及血腦屏障方面考察丹紅注射液在腦缺血病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)中不同環(huán)節(jié)的保護(hù)作用,從而初步明確丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn),為后期機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。3.基于組學(xué)技術(shù)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究:在明確丹紅注射液對(duì)腦缺血不同環(huán)節(jié)具有保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),考察丹紅注射液對(duì)腦缺血狀態(tài)下海馬組織中蛋白質(zhì)譜的影響,通過數(shù)據(jù)分析和挖掘,篩選出具有特征變化的相關(guān)蛋白以及這些蛋白可能富集到的通路,并對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí)利用靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù),進(jìn)一步考察了其對(duì)腦缺血狀態(tài)下大腦皮層相關(guān)氨基酸代謝變化情況,進(jìn)而從不同層面綜合闡釋丹紅注射液對(duì)腦缺血的保護(hù)作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.基于數(shù)據(jù)挖掘的丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)研究結(jié)果共納入方劑39首、中成藥74種,其中發(fā)現(xiàn)丹參、紅花常與活血、行氣之品聯(lián)用,且絕大部分藥物歸心、肝經(jīng),主以胸痹、真心痛、心悸、中風(fēng)、瘀血疼痛證、婦科病等為治療病證。2.基于腦缺血病理反應(yīng)相關(guān)環(huán)節(jié)的丹紅注射液抗腦缺血作用特點(diǎn)研究(1)丹紅注射液抗腦缺血量-效、時(shí)-效研究不同劑量(1.44、0.72、0.36、0.18mL/kg)丹紅注射液干預(yù)腦缺血模型大鼠,以0.72mL/kg效果最佳,且0.72 mL/kg、0.36 mL/kg、0.18 mL/kg劑量之間呈現(xiàn)量效關(guān)系,0.72mL/kg丹紅注射液抗腦缺血作用24h療效優(yōu)于12h。(2)丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠血腦屏障通透性的影響丹紅注射液除可改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積外,還可以減輕腦水腫和血腦屏障崩解程度,并對(duì)腦缺血狀態(tài)下腦組織、心肌組織中的α-actinin蛋白含量均有調(diào)整作用,提示α-actinin蛋白變化可能是丹紅注射液治療腦病、心病的共同分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。(3)丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)凋亡的影響腦缺血后大鼠海馬組織表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞凋亡,缺血誘導(dǎo)了 Apaf-1及其下游分子Caspase-9、Caspase-3的表達(dá),并且增加Bax表達(dá),降低Bcl-2的表達(dá),從而降低Bcl-2/Bax比值;丹紅注射液可顯著抑制Apaf-1及Caspase-9、Caspase-3的激活,逆轉(zhuǎn)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值的變化。提示丹紅注射液可通過抑制腦缺血大鼠海馬組織Apaf-1的表達(dá),從而抑制Caspase信號(hào)通路活性來(lái)發(fā)揮抗凋亡的作用,使Caspase介導(dǎo)的缺血核心周邊半暗帶細(xì)胞凋亡擴(kuò)展減慢。3.基于組學(xué)技術(shù)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究(1)基于靶標(biāo)代謝組學(xué)的丹紅注射液抗腦缺血作用研究研究顯示:腦缺血大鼠供能氨基酸(Val、Ile、Leu、Lys)和神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸(Gln、Glu、Gly、Ser、Tau、Tyr、Phe)變化顯著,丹紅注射液可選擇性調(diào)節(jié)腦中供能氨基酸的異常,降低Glu含量,并抑制Gln、Gly、Ser對(duì)其興奮毒性的放大。提示丹紅注射液可通過改善腦能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的釋放/合成,進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。(2)基于蛋白質(zhì)組學(xué)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究以蛋白質(zhì)組學(xué)為研究手段,發(fā)現(xiàn)與丹紅注射液抗腦缺血作用顯著相關(guān)的蛋白有12個(gè)(Gsk-3β、Cnsklg1、Gpc4、Ctbp2、Acta2、Apc、Akt1、Sos1、Prkaa1、Eef2、Flnc、Rap1a),主要富集于WNT信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路,并對(duì)其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析,獲得以Gsk-3β和Akt1為中心節(jié)點(diǎn)的與其它潛在靶標(biāo)蛋白共同組成的蛋白網(wǎng)絡(luò),結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除Ctbp2外其余11個(gè)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致,且Gsk-3β蛋白抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了丹紅注射液參與了候選蛋白質(zhì)在腦缺血損傷海馬組織中的表達(dá)變化。綜上所述,通過本研究初步揭示了丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn)、蛋白網(wǎng)絡(luò)、相關(guān)信號(hào)通路以及氨基酸代謝情況,從而系統(tǒng)闡釋活血化瘀方(丹紅注射液)抗腦缺血的作用及其機(jī)制;另外,所獲得的蛋白網(wǎng)絡(luò)可能是腦缺血病理機(jī)制的核心單元,進(jìn)而為認(rèn)識(shí)和防治腦缺血提供參考和依據(jù)。本研究創(chuàng)新點(diǎn)1.揭示了丹紅注射液抗腦缺血作用與改善能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的釋放/合成,抑制神經(jīng)元凋亡以及保護(hù)血腦屏障有關(guān);2.揭示了丹紅注射液抗腦缺血作用相關(guān)的由12個(gè)蛋白組成的網(wǎng)絡(luò),涉及三條信號(hào)通路,即WNT信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：1293225