本文關(guān)鍵詞：自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景Pompe病又稱作糖原貯積病Ⅱ型,為常染色體隱性遺傳,是由于溶酶體內(nèi)酸性α-糖苷酶(acid alpha-glucosidase,GAA)缺陷引起,可發(fā)生于任何年齡。酸性α-糖苷酶(GAA)主要負(fù)責(zé)在溶酶體內(nèi)降解糖原為葡萄糖,其缺陷可導(dǎo)致多種組織內(nèi)溶酶體糖原不能被降解而蓄積。Pompe病是世界上第一種被確定的溶酶體貯積病,同時(shí)也是唯一的既是糖原貯積病又是溶酶體貯積病的致死性疾病。Pompe病臨床異質(zhì)性很強(qiáng),根據(jù)發(fā)病年齡、疾病進(jìn)展速度以及受累器官嚴(yán)重程度將其主要分為兩大類(lèi):嬰兒型和晚發(fā)型。嬰兒型主要表現(xiàn)為心肺功能障礙,而晚發(fā)型臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肢帶肌無(wú)力,此外還包括一些特殊的臨床表現(xiàn)形式如急性呼吸功能不全和表現(xiàn)為椎基底動(dòng)脈或頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)血管迂曲擴(kuò)張、多發(fā)狹窄、動(dòng)脈瘤的腦血管病變。一直以來(lái)糖原貯積�、蛐偷陌l(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與肌細(xì)胞溶酶體內(nèi)過(guò)多的糖原累積而溶酶體沒(méi)有足夠空間進(jìn)行擴(kuò)展,以致溶酶體最終破裂有關(guān)即經(jīng)典的溶酶體腫脹破裂理論。但是隨著近年來(lái)Pompe病動(dòng)物模型的建立和酶替代治療的應(yīng)用以及電鏡技術(shù)的發(fā)展,自噬在Pompe病發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視。大量的實(shí)驗(yàn)證明,自噬聚集和溶酶體腫脹破裂理論在Pompe病的發(fā)病機(jī)理中均占有一席之地,但是二者好像并不能同時(shí)為主。在嬰兒型患者其骨骼肌病理主要是以溶酶體腫脹破裂為主,經(jīng)過(guò)酶替代治療后自噬才變得更為明顯,而在晚發(fā)型患者其骨骼肌的主要病理特征則是自噬聚集。Pompe病不再單純的被認(rèn)為是一種糖原貯積病,溶酶體不能降解糖原以及肌纖維各種自噬空泡的堆積共同導(dǎo)致肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙、持續(xù)的自噬聚集以及明顯的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的異常,所述這些變化都會(huì)增強(qiáng)自噬活性以及影響肌纖維收縮性。上調(diào)或下調(diào)自噬活性都是在尋求一種平衡。所以調(diào)控自噬要找到平衡點(diǎn),從而為尋求新的治療方法提供依據(jù)。自噬最早于1962年由Ashford和Porten提出,是一種進(jìn)化上高度保守的溶酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程,又稱為溶酶體自噬系統(tǒng),是一種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制,主要分為三類(lèi):大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。在生理狀態(tài)下自噬于大多數(shù)組織內(nèi)主要提供胞漿內(nèi)組分的常規(guī)循環(huán),清除受損分子和異常聚集的蛋白質(zhì),經(jīng)過(guò)代謝后的大分子被再利用,從而維持細(xì)胞內(nèi)組分生成與降解的平衡,而同時(shí)自噬更是細(xì)胞應(yīng)對(duì)饑餓和其它應(yīng)激狀態(tài)的一種生存機(jī)制。凋亡即Ⅰ型程序性死亡,定義為自殺式細(xì)胞死亡,以核染色質(zhì)濃縮為主要形態(tài)學(xué)特征,而自噬的特征為空泡內(nèi)胞漿內(nèi)容物被包裹后由溶酶體酶進(jìn)行降解,又稱為Ⅱ型程序性死亡,自噬和凋亡之間關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。應(yīng)激狀態(tài)下自噬能移除損傷的細(xì)胞器利于修復(fù)或者通過(guò)代謝細(xì)胞大分子提供額外的ATP有助于繼續(xù)生存,而隨著應(yīng)激狀態(tài)的變化自噬的作用也隨之轉(zhuǎn)換。凋亡在衰老、腫瘤、惡病質(zhì)、溶血、肥胖及燒傷引起的肌萎縮中的作用越來(lái)越受到重視。迄今為止有關(guān)凋亡在Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制尚不明確。凋亡和自噬的分子機(jī)制雖截然不同,但目前已有研究證實(shí)在自噬和凋亡的通路中存在一些共同調(diào)節(jié)分子,在某些條件下自噬能作為凋亡的上游或者是和凋亡一起觸發(fā)細(xì)胞死亡,提示凋亡和自噬在某種通路上存在交叉點(diǎn),可以相互影響,而且在特定的環(huán)境下自噬從保護(hù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)或直接參與細(xì)胞死亡,也可以說(shuō)是在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過(guò)程中細(xì)胞凋亡與自噬保持著動(dòng)態(tài)平衡。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)自噬和凋亡在衰老過(guò)程肌肉萎縮的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,而有關(guān)二者在Pompe病發(fā)病機(jī)理的作用機(jī)制在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本課題通過(guò)免疫組化、雙重免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法,首次檢測(cè)了 caspase-8在晚發(fā)型Pompe病患者活檢肌組織內(nèi)有無(wú)表達(dá),首次檢測(cè)了 VMP1和p62在晚發(fā)型Pompe病患者活檢肌組織內(nèi)有無(wú)共表達(dá),首次證實(shí)LAMP-2和catheps in B可在晚發(fā)型Pompe病疾病發(fā)展的某一階段共表達(dá)于活檢肌組織,初步探討了自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制,向明確晚發(fā)型Pompe病的發(fā)病機(jī)制又邁進(jìn)了一步,并為尋找Pompe病的新的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分觀察自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病患者骨骼肌中的發(fā)生及分布特點(diǎn)目的觀察 LC3B、LAMP-2、VMP1、p62 和 Bcl-2、cathepsinB 在晚發(fā)型 Pompe 病患者骨骼肌活檢肌肉中的表達(dá)及特點(diǎn)。方法總結(jié)分析進(jìn)行肌肉活檢的Pompe病患者10例,10例患者均為晚發(fā)型�？偨Y(jié)Pompe病患者的臨床資料和病理學(xué)特點(diǎn),同時(shí)另選3例正常對(duì)照患者進(jìn)行肌活檢。所有活檢肌肉組織均分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)染色以及溶酶體相關(guān)膜蛋白-2(lysosome associated membrane protein-2,LAMP-2)、微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、空泡膜蛋白1(vacuole membrane protein 1,VMP1)、p62、Bcl-2 和 cathepsin B 的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果1.10例Pompe病患者骨骼肌病理改變主要表現(xiàn)為肌纖維大小不等,其內(nèi)可見(jiàn)大量空泡,空泡形態(tài)不規(guī)則,部分空泡內(nèi)含嗜堿性顆粒樣物質(zhì)。偶見(jiàn)壞死及再生纖維,肌內(nèi)膜不同程度增生,肌原纖維間網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)紊亂,肌纖維內(nèi)糖原含量增多。病理表現(xiàn)個(gè)體差異較大,即使在同一患者骨骼肌標(biāo)本可出現(xiàn)部分區(qū)域肌纖維輪廓清晰,纖維內(nèi)也沒(méi)有空泡形成,僅呈裂隙狀,而另一區(qū)域卻可見(jiàn)大片結(jié)構(gòu)紊亂的肌纖維。2.酸性磷酸酶染色結(jié)果在HE染色明顯空泡化的區(qū)域,酸性磷酸酶染色呈弱陽(yáng)性;在HE染色呈紫紅色顆粒區(qū)域,酸性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性;在空泡化不十分嚴(yán)重或者僅僅點(diǎn)狀分布區(qū)域,酸性磷酸酶染色亦呈弱陽(yáng)性,且在肌纖維核心區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)。3.免疫組化染色結(jié)果LAMP-2、p62在10例患者肌組織內(nèi)均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而VMP1、LC3B、Bcl-2和cathepsinB在晚發(fā)型Pompe病患者活檢肌組織內(nèi)的表達(dá)程度變異較大。LC3B在多數(shù)肌纖維破壞較重的區(qū)域幾乎不表達(dá)或部分點(diǎn)狀弱表達(dá),部分空泡化嚴(yán)重的肌纖維內(nèi)陽(yáng)性表達(dá),尚未空泡化肌纖維核心區(qū)域呈點(diǎn)狀或團(tuán)塊樣陽(yáng)性表達(dá),不完全空泡化肌纖維呈弱表達(dá)。VMP1在空泡化較重的肌纖維內(nèi)不表達(dá),在尚未完全空泡化的肌纖維內(nèi)可有陽(yáng)性表達(dá),Bcl-2在空泡化較重的肌纖維肌膜表達(dá)陽(yáng)性,不完全空泡化的肌纖維內(nèi)弱陽(yáng)性表達(dá),而尚未空泡化的肌纖維部分弱表達(dá)。cathepsin B在破壞較重的肌纖維內(nèi)不表達(dá)或者弱表達(dá),在不完全空泡化或者尚未空泡化的肌纖維內(nèi)可呈陽(yáng)性表達(dá);正常對(duì)照組各種染色均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論在晚發(fā)型Pompe病患者受累的骨骼肌組織中,LAMP-2、LC3B、VMP1、p62、Bcl-2、cathepsinB有著不同程度的表達(dá),且分布區(qū)域不同,其與骨骼肌肌纖維破壞的程度相關(guān),提示自噬和凋亡可能共同參與了晚發(fā)型Pompe病肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞,在其不同的發(fā)展階段發(fā)揮著不同的作用。第二部分初步探討自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制目的檢測(cè)caspase-8(p18)的表達(dá)以及分別通過(guò)檢測(cè)LAMP-2和cathepsinB、LC3B 的共表達(dá),以及空泡膜蛋白 1(vacuole membrane protein 1,VMP1)和 p62的共表達(dá),以探討自噬和凋亡在晚發(fā)型Pompe病發(fā)病機(jī)理中的作用機(jī)制。方法選取行肌肉活檢的患者16例,其中晚發(fā)型Pompe病患者10例,3例脂質(zhì)沉積性肌病(lipid storage myopathy,LSM)患者、正常對(duì)照組3例。全部活檢標(biāo)本均行 LAMP-2、LC3B、caspase-8(p18)、cathepsinB、VMP1、p62 免疫熒光染色,并用雙重免疫熒光方法分別檢測(cè)LAMP-2和LC3B、cathepsinB,V VMP1和p62的共表達(dá)。結(jié)果免疫熒光染色顯示在空泡化明顯的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)主要可見(jiàn)LAMP-2和p62的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),在LSM患者肌肉組織內(nèi)亦有不同程度的表達(dá)。LC3B、cathepsin B、VMP1、caspase-8(p18)染色結(jié)果接近,表現(xiàn)為在空泡化明顯的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)呈弱表達(dá)甚至不表達(dá),而在受累肌纖維尚未空泡化或僅僅點(diǎn)狀改變時(shí)陽(yáng)性表達(dá)。在尚未空泡化或者輕度空泡化的晚發(fā)型Pompe病患者肌纖維內(nèi)可以檢測(cè)到VMP1和p62的共表達(dá)以及LAMP-2和cathepsin B的共表達(dá),共表達(dá)主要集中在肌纖維的核心區(qū)域。而在明顯空泡化的肌纖維內(nèi),均未發(fā)現(xiàn)共表達(dá)。正常對(duì)照組各染色均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在晚發(fā)型Pompe病患者肌肉組織病理生理機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。VMP1介導(dǎo)的選擇性自噬途徑在晚發(fā)型Pompe病肌肉組織中可能有保護(hù)作用,可能成為晚發(fā)型Pompe病患者新的治療靶點(diǎn)。自噬和凋亡相關(guān)蛋白在晚發(fā)型Pommpe病受累骨骼肌不同的發(fā)展階段可能發(fā)揮著不同的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R596

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Yong-Jun Fan;Wei-Xing Zong;;The cellular decision between apoptosis and autophagy[J];Chinese Journal of Cancer;2013年03期

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本文編號(hào)：1292843