本文關(guān)鍵詞：Trop2對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機制研究

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【摘要】：研究背景胃癌是世界五大常見腫瘤之一,其致死率位列第三[1-3]。在東亞地區(qū),胃癌是發(fā)病率最高的癌癥之一,每年約有70%的胃癌新發(fā)病例和死亡發(fā)生在東亞、東歐和南美,而中國就占到所有人數(shù)的42%[4-6]。中國是胃癌高發(fā)國家,胃癌在中國男性人群中的發(fā)病率僅次于肺癌,位列第二,在中國女性人群中居第四位[2]。近年來,隨著人們衛(wèi)生條件的提高和飲食習(xí)慣的改善,胃癌的發(fā)病率有下降的趨勢,但是由于胃癌具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率等特點,導(dǎo)致其生存預(yù)后情況差異很大,晚期胃癌的5年生存率仍低于20%。針對胃癌的傳統(tǒng)治療方法,如手術(shù)、放療、化療并未明顯改善胃癌病人的預(yù)后,因此迫切需要創(chuàng)新腫瘤治療手段。研究表明,一些基因可能對胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[7],針對這些基因的靶向治療取得了一些進步,但是由于腫瘤形成的異質(zhì)性,多種基因間的相互作用,以及靶向藥物載體的局限等原因,導(dǎo)致胃癌的靶向治療效果不佳。因此,迫切需要尋找新的治療靶點,為胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機制的深入研究以及精準(zhǔn)醫(yī)療提供可靠的理論依據(jù)。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原 2(human trophoblast cell surface antigen 2,TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1),位于染色體 1q32[8]。Trop2 最早發(fā)現(xiàn)在人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面[9,10],是單跨膜蛋白,約36kDa,分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)和一個磷酸化的胞質(zhì)尾[11]。Trop2能夠被腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)轉(zhuǎn)化酶裂解為胞外域和胞內(nèi)域,胞內(nèi)域從跨膜區(qū)離開后直接進入胞漿或核內(nèi)從而發(fā)揮生物學(xué)作用[12]。Trop2主要在上皮組織腫瘤中高表達,并能夠促進腫瘤的惡性生物學(xué)行為[13]。本實驗室自2009開始對Trop2基因進行研究,前期的實驗表明,Trop2基因在乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌中高表達,但是關(guān)于TroP2基因?qū)ξ赴┑挠绊懮形匆妶蟮�。上�?間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)現(xiàn)象是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理條件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[14],在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15],將腫瘤細(xì)胞重新編程,使其具有干細(xì)胞特性[16-18]。為了適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的變化,在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期,腫瘤細(xì)胞就會發(fā)生很多表型的改變[19]。而正常的上皮組織多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)不利于惡性腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲,腫瘤細(xì)胞為了獲得運動能力就要通過發(fā)生EMT變化而失去上皮表型(細(xì)胞間粘附、基頂極性以及非移動性)和上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物,如E-鈣黏附蛋白(E-cadherin),并得到間質(zhì)表型(可移動性、侵襲能力以及抗凋亡能力)和間質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物,如纖維連接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)等[20-22]。因此,EMT現(xiàn)象在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期出現(xiàn)是非常重要和必不可少的。本課題首先應(yīng)用免疫組化技術(shù),通過830例臨床胃癌組織芯片分析Trop2與臨床病理因素、預(yù)后的相關(guān)性,評價Trop2作為胃癌靶向治療分子靶點的可行性;在第二部分的研究中我們分別從體內(nèi)和體外實驗探討TroP2對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響,發(fā)現(xiàn)Trop2在胃癌上具有促進胃癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡,并能促進胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;最后我們通過臨床標(biāo)本和動物實驗證實Trop2的表達和間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物vimentin的表達相關(guān)聯(lián),進而利用體外實驗闡明Trop2能夠介導(dǎo)β-catenin促進vimentin的表達,從而誘導(dǎo)胃癌EMT現(xiàn)象及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。研究目的1.從胃癌臨床標(biāo)本、細(xì)胞學(xué)實驗和動物實驗三個層次研究Trop2對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響和Trop2作為胃癌新靶點的可行性。2.闡明Trop2可能通過調(diào)控β-catenin促進vimentin的表達,從而誘導(dǎo)胃癌EMT現(xiàn)象和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。研究方法1.選擇41對胃癌組織和癌旁組織新鮮標(biāo)本,實時定量RT-PCR檢測Trop2 mRNA的表達水平;用免疫組化方法檢測Trop2在830例胃癌組織芯片中的表達情況,并結(jié)合臨床病理資料分析其臨床意義,探討Trop2的表達與胃癌臨床病理分期、預(yù)后等的關(guān)系。2.選擇Trop2高表達和低表達各兩株胃癌細(xì)胞系,分別敲減和過表達Trop2,CCK8法和平板克隆實驗檢測胃癌細(xì)胞增殖,FACS檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化。分別選用shRNA-NC和shRNA-Trop2穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株,制備裸鼠皮下成瘤模型,通過測量瘤體積和瘤重,比較Trop2敲減后對胃癌的抑制作用。3.免疫組化檢測EMT表面標(biāo)志物vimentin和Trop2在248例人胃癌組織及86例癌旁組織中的表達情況,分析兩個基因表達的關(guān)聯(lián),以及與胃癌轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后等的相關(guān)性。4.檢測過表達或敲減Trop2后胃癌細(xì)胞上EMT表面標(biāo)志物(E-cadherin,vimentin 和 fibronectin)及 p-catenin、goocecoid、snail 等 EMT 轉(zhuǎn)錄因子的表達變化;TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株EMT模型,檢測EMT模型中Trop2和EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達變化;免疫共沉淀實驗檢測Trop2和p-catenin間的相互作用;同時檢測Trop2,β-catenin,vimentin在胃癌細(xì)胞株,EMT模型細(xì)胞株,敲除Trop2的EMT模型細(xì)胞株上表達情況;激光共聚焦顯微鏡觀察β-catenin、vimentin在過表達/敲減Trop2胃癌細(xì)胞株、EMT模型細(xì)胞株上敲除Trop2后的表達變化情況,分析TroP2對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制。5.分別選用shRNA-NC和shRNA-Trop2穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株,注射裸鼠尾靜脈制備轉(zhuǎn)移瘤模型,5周后處死裸鼠,分離出肺組織,比較組別間肺組織的重量和轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量,IHC檢測肺組織轉(zhuǎn)移瘤的Trop2、ki67、vimentin表達情況,分析Trop2對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。研究結(jié)果1.實時定量RT-PCR檢測41對人胃癌新鮮標(biāo)本和癌旁組織,結(jié)果顯示Trop2 mRNA在胃癌組織中的表達比癌旁組織高2.32±1.44倍;免疫組化檢測830例不同類型的人胃癌組織芯片,結(jié)果顯示,TroP2在胃癌組織中陽性表達率高于癌旁組織、慢性胃炎組織、低級別瘤變和高級別瘤變;胃癌中Trop2的表達與胃癌分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、幽門螺旋桿菌感染等相關(guān),Trop2高表達預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良,提示Trop2可以作為一個新的胃癌分子靶點。2.細(xì)胞實驗結(jié)果顯示,TroP2能促進胃癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力,并能減少胃癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量;過表達Trop2后,胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強,敲減Trop2能抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力;Trop2促進胃癌細(xì)胞周期中S期所占比例明顯增多。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲減Trop2在體內(nèi)能明顯抑制腫瘤的增殖能力,抑瘤率達到50.40%。免疫組化結(jié)果顯示,和空載對照組的腫瘤組織相比,shRNA-Trop2組的腫瘤組織中Trop2表達量相對較低。結(jié)果提示Trop2對胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有促進作用。3.免疫組化檢測248例胃癌組織及86例癌旁組織中Trop2和vimentin的表達水平。結(jié)果顯示,Trop2和vimentin的表達呈正相關(guān),Trop2和vimentin在胃癌組織中陽性表達率高于癌旁組織;胃癌組織中TroP2+/vimentin+表達和分化、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移等相關(guān),Trop2+/vimentin+預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良,提示胃癌中TroP2的表達可能和胃癌EMT現(xiàn)象有關(guān)。4.細(xì)胞水平實驗結(jié)果顯示,western-blot和實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,Trop2可上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型vimentin和fibronectin,下調(diào)上皮細(xì)胞表型E-cadherin,同時上調(diào)EMT調(diào)控因子β-catenin;TGF-β1能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系發(fā)生EMT現(xiàn)象,誘導(dǎo)7天后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,免疫熒光和實時定量RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞E-cadherin表達量減少,vimentin和fibronectin表達量增加,證實EMT模型誘導(dǎo)成功;EMT模型組細(xì)胞Trop2表達明顯增加,同時上調(diào)EMT調(diào)控因子β-catenin;免疫共沉淀實驗推測Trop2和β-catenin可在胞內(nèi)發(fā)生結(jié)合;Western-blot實驗結(jié)果顯示Trop2能通過上調(diào)β-catenin促進胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象;激光共聚焦顯微鏡進一步觀察到Trop2能通過促進β-catenin核內(nèi)聚集,上調(diào)EMT表面標(biāo)志物vimentin的表達。提示Trop2能通過上調(diào)β-catenin促進vimentin表達,進而誘導(dǎo)胃癌EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。5.在體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型中,敲減Trop2的胃癌細(xì)胞經(jīng)裸鼠尾靜脈注射后,肺部轉(zhuǎn)移瘤形成數(shù)量少于空載對照組;肺部轉(zhuǎn)移瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示,Trop2敲減組的Trop2、vimentin和Ki67的表達量明顯少于空載對照組。研究結(jié)論1.Trop2在胃癌組織高表達,其高表達與胃癌分化、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和幽門螺旋桿菌感染有關(guān),并預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良,提示TroP2可作為治療胃癌的分子靶點。2.Trop2高表達可促進胃癌細(xì)胞的增殖,抑制凋亡,促進胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力,以及細(xì)胞的有絲分裂能力。3.Trop2和vimentin在胃癌組織上共同高表達,并呈正相關(guān);胃癌組織中Trop2+/vimentin+表達和分化、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移等相關(guān),Trop2+/vimentin+預(yù)示著胃癌病人的預(yù)后不良,提示胃癌中TroP2的表達可能和胃癌EMT現(xiàn)象有關(guān)。4.Trop2能通過調(diào)控β-catenin促進vimentin表達,從而誘導(dǎo)胃癌EMT現(xiàn)象和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 龐翠;張菊;劉文超;;EMT研究進展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2016年15期

2 杜建;唐小利;;精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的內(nèi)涵演化、重點領(lǐng)域與我國發(fā)展對策[J];中國科學(xué)基金;2016年01期

3 褚楚;劉金榮;張慧林;唐小軍;林紅;劉鵬;蘇亦平;馮振卿;童華;朱進;;人源抗Trop-2 Fab對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年03期

4 王歡;劉瓊瓊;唐小軍;徐鑫;褚楚;熊四平;鄭峰;童華;朱進;馮振卿;林紅;;人源抗TROP2全分子抗體IgG的真核表達及對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年07期

5 Razia S Aziz-Seible;Carol A Casey;;Fibronectin: Functional character and role in alcoholic liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年20期

6 ;Elevated expression of mature miR-21 and miR-155 in cancerous gastric tissues from Chinese patients with gastric cancer[J];Journal of Biomedical Research;2010年03期

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本文編號：1292835