本文關(guān)鍵詞：蝦青素對后負(fù)荷增高導(dǎo)致的小鼠心臟功能紊亂的作用及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景心力衰竭(簡稱為心衰)是由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常所導(dǎo)致的一種臨床綜合征。是由各種原因引起心肌損傷,從而導(dǎo)致心室充盈和射血能力受損,心臟泵血功能降低。心衰是大多數(shù)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末期表現(xiàn),也是多數(shù)心血管疾病患者死亡的直接原因。冠心病、高血壓、心肌病等多種疾病均可導(dǎo)致心臟功能下降至心臟功能失代償。其中后負(fù)荷增高可見于高血壓病、主動脈狹窄等心血管疾病,后負(fù)荷增高可使得心臟的收縮壓力被迫增加,前期以心肌纖維增粗肥大進(jìn)行代償工作,后期則因為代償能力下降而導(dǎo)致心臟功能受損。心臟是一個高耗氧的重要器官,心肌細(xì)胞對氧氣的需求量極大,對心肌細(xì)胞的供氧能力極大地影響著心臟的功能。在心臟的各級血管中,微血管是與心肌細(xì)胞進(jìn)行直接物質(zhì)氣體交換的血管,所以其密度與功能正常與否直接影響心肌細(xì)胞的收縮能力。在心臟后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心肌肥大過程中,微血管的密度會出現(xiàn)相對減少,并且微血管的結(jié)構(gòu)也會因為機(jī)械壓力增加、周圍化學(xué)環(huán)境的改變及氧化應(yīng)激增加而改變,微血管的功能進(jìn)而受損,最終影響心臟的功能。從該角度出發(fā),尋找有效的改善微血管功能的干預(yù)措施或藥物具有極大的臨床及社會價值。蝦青素(Astaxanthin,AST)是一種葉黃素,屬于類胡蘿卜素的一種,具有極強(qiáng)的抗氧化能力,體外實驗中發(fā)現(xiàn)蝦青素抗氧化能力是維生素E的100～500倍。近年來,雖然已有研究發(fā)現(xiàn)蝦青素對心臟具有保護(hù)作用,然而對長期后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心力衰竭及心肌微血管的作用卻鮮有報道。因此,本課題利用后負(fù)荷增高誘導(dǎo)的小鼠心衰模型,初步研究蝦青素對心臟功能及心肌微血管的作用。本課題研究將進(jìn)一步了解蝦青素的作用及機(jī)制,為心衰的預(yù)防或治療提供新的思路,具有重要的理論意義及臨床指導(dǎo)意義。研究目的1、研究蝦青素對后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心臟功能紊亂的作用;2、明確蝦青素在胸主動脈縮窄術(shù)12周后的心肌中的抗氧化作用;3、初步研究蝦青素對心肌微血管的作用。研究方法1、胸主動脈縮窄術(shù)(thoracic aortic constriction,TAC):本實驗采用8周齡雄性C57BL/6小鼠行胸主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)心力衰竭形成,對小鼠行胸主動脈縮窄術(shù)或?qū)φ帐中g(shù)。本實驗選取頸部為手術(shù)部位,分離出頭臂干與左側(cè)頸總動脈起始部,將帶針縫合線于主動脈弓處小心環(huán)繞一周后與針頭(27G)同時結(jié)扎,快速退出針頭。對照手術(shù)組即假手術(shù)組(SHAM組)小鼠僅給予帶針縫合線繞過主動脈弓取出,不行打結(jié),余操作同手術(shù)組;2、分組及灌胃方法:共64只小鼠,隨機(jī)分配至SHAM、TAC、蝦青素低劑量組(TAC+AST-L)及蝦青素高劑量組(TAC+AST-H組),每組16只。蝦青素提前用生理鹽水制成混懸液,低劑量組用量75mg/kg/d,高劑量組用量200mg/kg/d;SHAM組給予等體積生理鹽水做對照;3、心臟超聲測量:分別于灌胃0、4、8及12周時對小鼠進(jìn)行心臟超聲測量,用M-mode、2D-mode模式評價左室收縮功能,用Pulse Wave Doppler評價二尖瓣前向血流速度,用Tissue Doppler評價二尖瓣瓣環(huán)心肌組織動度。用Color Doppler評價主動脈弓處血流用以鑒定模型成功與否;4、取材:留取血標(biāo)本,用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清中心衰指標(biāo)腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平;留取心臟標(biāo)本,用于后續(xù)病理及分子生物學(xué)實驗;5、病理學(xué)檢測:心肌組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法,觀察心肌組織病理改變;6、超微結(jié)構(gòu)觀察:利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察心肌肌纖維及微血管結(jié)構(gòu)改變;7、免疫組織化學(xué)染色:觀察心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)4-羥基壬烯醛(4 Hydroxynonenal,4HNE)與 8-羥化脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG),并通過血管內(nèi)皮指標(biāo)CD31染色情況觀察微血管密度及數(shù)量;8、Western blot:剪取左室心肌組織,提取總蛋白,用Western blot方法檢測CD31 水平,并檢測缺氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體 2(vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2)促血管生成指標(biāo)的蛋白表達(dá),并計算相對表達(dá)量;9、統(tǒng)計學(xué)分析:實驗結(jié)果采用IBM SPSS Statistic 19分析軟件進(jìn)行分析,采用t檢驗及單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行分析,計量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1、各組小鼠體重、心臟及肺重量比較:灌胃12周后各組體重比較無明顯差異(P0.05),與假手術(shù)組相比,TAC組及AST低劑量組中心臟、肺重量以及與體重的比值均明顯增加(均P0.05),與TAC組相比,AST高劑量組中心臟、肺的重量以及與體重比值明顯降低(均P0.05)。2、各組小鼠心臟功能的比較:與假手術(shù)組相比,TAC組及低劑量組中LVEF(%)、E/A及Ea/Aa比值下降,BNP水平升高(均P0.05);與TAC組相比,高劑量組LVEF(%)、E/A、Ea/Aa比值升高,BNP水平下降(均P0.05);低劑量組與TAC組相比,無明顯變化(P0.05)。與假手術(shù)組相比,TAC組小鼠心臟增大,重構(gòu)明顯,尤以左心明顯,蝦青素低劑量組無明顯改善,而高劑量組心臟大小較TAC組明顯減小,左心室也明顯較小。以上結(jié)果初步表明AST能改善心臟重構(gòu)。3、各組小鼠心肌組織病理改變:與假手術(shù)組相比,TAC組的HE染色顯示肌纖維增粗、排列紊亂,甚至斷裂;超微結(jié)構(gòu)觀察顯示部分肌原纖維溶解,Z線排列不規(guī)則或消失,線粒體數(shù)量增加、排列紊亂,且有較多的鈣鹽樣致密顆粒沉積,低劑量蝦青素組心肌改變與TAC相似,蝦青素高劑量組中,雖也有上述改變,但與TAC組相比,有明顯改善。4、各組心肌組織氧化應(yīng)激損傷情況:4HNE與8-OHdG分別是脂質(zhì)與核酸的氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物。免疫組化染色顯示與假手術(shù)組相比,TAC及低劑量組中4HNE染色陽性區(qū)域及8-OHdG陽性細(xì)胞核百分比增加(均P0.05),與TAC組相比,高劑量組中明顯減少(P0.05)。5、各組心肌微血管改變:CD31免疫組化染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,TAC術(shù)后心肌微血管密度減少(P0.05),Western blot檢測顯示TAC術(shù)后12周,CD31、HIF1α、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)均明顯減少(P0.05),給予高劑量蝦青素時,能明顯改善TAC導(dǎo)致的微血管密度降低及血管生成相關(guān)蛋白分子表達(dá)的減少(P0.05),而低劑量蝦青素則對TAC術(shù)后的上述改變沒有影響(P0.05);透射電鏡結(jié)果顯示TAC術(shù)后心肌微血管出現(xiàn)痙攣、管壁不規(guī)則、管腔狹窄,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)不均勻,吞飲泡減少,此外,TAC組中管腔外有電鏡染料滲出表明管壁通透性增加,而蝦青素組(高劑量)中上述有害改變不明顯。6、各組小鼠生存率比較:術(shù)后12周,與假手術(shù)組組相比,TAC、TAC+AST-L和TAC+AST-H三個組的生存率均下降(均P0.05),但是接受TAC手術(shù)的各組相比,生存率沒有明顯差異,即蝦青素在術(shù)后12周對小鼠生存率沒有影響(P0.05)。結(jié)論1、主動脈縮窄導(dǎo)致小鼠心臟后負(fù)荷增加,術(shù)后12周成功建立了小鼠心力衰竭模型,而蝦青素能明顯改善后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心臟功能紊亂;2、蝦青素能顯著減輕后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心肌氧化應(yīng)激損傷;3、蝦青素能增加心肌微血管密度并改善微血管結(jié)構(gòu)。研究背景心肌纖維化是在多種心臟疾病中廣泛存在的病理過程,是導(dǎo)致心臟功能下降的主要原因之一。纖維化過程中,心肌成纖維細(xì)胞增殖并向肌成纖維細(xì)胞分化,生成過多的細(xì)胞外基質(zhì),膠原纖維過量沉積,膠原組成成分比例失調(diào),并且在心肌中的空間排列方式發(fā)生改變。心肌間質(zhì)中纖維化程度增加,使室壁僵硬度增加,順應(yīng)性下降,進(jìn)一步影響心臟收縮舒張功能;心臟冠脈血管周圍膠原沉積過多,使冠脈血流儲備下降,容易導(dǎo)致心肌缺血缺氧,進(jìn)一步出現(xiàn)心肌壞死;此外,心肌纖維化增加,還可介導(dǎo)異常折返通路的形成,使心肌的電活動出現(xiàn)異常,是心律失常甚至惡性心律失常發(fā)生的病理基礎(chǔ)。在纖維化的過程中,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)發(fā)揮著重要作用。其下游SMAD蛋白家族是最早被公認(rèn)的TGF-β信號傳導(dǎo)分子,受體激動型 SMADs(receptor-activated SMADs,R-SMADs)中,SMAD2 和 SMAD3能與TGF-β受體直接作用并被磷酸化,與共同介導(dǎo)型SMAD4結(jié)合形成異源多聚體將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi),與DNA結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)。SMAD2與SMAD3的磷酸化形式為其活化形式,也是現(xiàn)有研究非常明確的重要形式,但近年來其它蛋白修飾方式逐漸被發(fā)現(xiàn),例如乙�；�,已有研究表明抑制SMAD3乙酰化能減輕腎臟纖維化。但是在后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心肌纖維化中,R-SMADs的乙酰化作用鮮有研究。沉默信息調(diào)節(jié)子 2 相關(guān)酶類(silent information regulator 2 related enzymes,Sirtuins)是酵母菌中發(fā)現(xiàn)的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶,哺乳動物可表達(dá)同源蛋白,SIRT1是其中一員,可以將核蛋白的賴氨酸位點去乙�；�,近年來的研究發(fā)現(xiàn)SIRT1也可以通過改變非組蛋白的乙酰化水平,進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及衰老過程。同時,已有研究證明氧化應(yīng)激可以降低SIRT1表達(dá)及活性,對于長期后負(fù)荷增高的心臟來說,心肌氧化應(yīng)激明顯增加,因而明確抗氧化物質(zhì)蝦青素是否影響SIRT1對更深入地研究蝦青素的作用機(jī)制是非常必要的在我們的第一部分中,研究表明蝦青素對心臟功能有保護(hù)作用,我們在這一部分進(jìn)一步研究蝦青素對后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心肌纖維化的影響,并通過體內(nèi)外模型深入探討SIRT1在該影響中的作用機(jī)制。研究目的1、通過體內(nèi)外模型研究蝦青素對心臟纖維化的作用;2、通過體內(nèi)外實驗研究蝦青素對SIRT1的影響;3、深入研究SIRT1在蝦青素心臟保護(hù)作用中的相關(guān)機(jī)制。研究方法1、動物實驗:本部分所用實驗動物除了與第一部分相同的SHAM、TAC(12周)、TAC+AST(高劑量)外,增加TAC+AST+EX-527組,同時增加SHAM+AST、SHAM+EX-527及TAC+EX527三組對照組,每組16只。根據(jù)第一部分實驗結(jié)果,本部分實驗中蝦青素灌胃劑量均為200mg/kg/d。2、細(xì)胞實驗:使用TGF-β1和(或)蝦青素刺激人心肌成纖維細(xì)胞(Human cardiac fibroblasts,HCFs),我們先通過濃度梯度確定最適濃度,在最適濃度刺激下,研究成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化情況、膠原合成情況及SIRT1的表達(dá)和活性;并利用siRNA干擾SIRT1表達(dá)后進(jìn)一步研究SIRT1在蝦青素對纖維化影響中的作用機(jī)制。3、Masson染色:觀察各組心肌組織纖維化情況;4、免疫組織化學(xué)染色:觀察心肌組織中α-血管平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、膠原 Ⅰ(collagenⅠ,COLⅠ)及 SIRT1 的表達(dá)情況;5、Western blot檢測:檢測各組心肌組織中及各組處理條件下細(xì)胞中SIRT1、α-SMA、COLⅠ、R-SMADs及磷酸化R-SMADs的表達(dá)水平;6、免疫沉淀:與Western blot方法聯(lián)合檢測組織及細(xì)胞中SMAD2和SMAD3的乙�；�;7、SIRT1活性檢測:利用SIRT1活性熒光檢測試劑盒對各組組織及細(xì)胞中SIRT1活性進(jìn)行檢測;8、免疫熒光染色:通過組織免疫熒光染色和細(xì)胞免疫熒光染色方法分別對組織及細(xì)胞中R-SMADs的核轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行觀察;并通過α-SMA及SIRT1染色觀察各組細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化及SIRT1的作用情況;9、實時熒光定量PCR:檢測各組組織及細(xì)胞中TGF-β、α-SMA、COLⅠ及SIRT1的轉(zhuǎn)錄水平,并檢測各組細(xì)胞TβRⅠ及TβRⅡ轉(zhuǎn)錄水平;10、雙熒光素酶報告基因:檢測不同處理條件下細(xì)胞中SMAD3的轉(zhuǎn)錄活性。11、統(tǒng)計學(xué)分析:實驗結(jié)果采用IBM SPSS Statistic 19分析軟件進(jìn)行分析,采用t檢驗及單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行分析,計量資料結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1、動物實驗1.1蝦青素延緩TAC誘導(dǎo)的心肌纖維化:Masson染色、α-SMA及COLⅠ的免疫組化染色顯示,與SHAM組相比,術(shù)后12周TAC組心肌纖維化明顯增加(P0.05),而TAC+AST組心肌纖維化較SHAM組相比無明顯變化(P0.05),說明蝦青素有抗纖維化作用。1.2 TAC術(shù)后(0周、4周、12周)心肌SIRT1表達(dá)變化:Western blot結(jié)果顯示較術(shù)后0周的心肌組織相比,術(shù)后4周的心肌SIRT1蛋白表達(dá)升高(P0.05),而術(shù)后12周的心肌組織SIRT1表達(dá)量較4周明顯減少(P0.05),甚至低于在術(shù)后0周的心肌組織中的表達(dá)量(P0.01)。1.3蝦青素抑制TAC導(dǎo)致的心肌SIRT1表達(dá)及活性的下降:結(jié)果顯示與TAC組相比,TAC+AST組中SIRT1轉(zhuǎn)錄、翻譯水平及活性均增加(P0.05)。SIRT1免疫組化結(jié)果顯示SIRT1主要表達(dá)在細(xì)胞核,TAC+AST組中SIRT1細(xì)胞核陽性率明顯高于TAC組中的陽性率(P0.05)。1.4抑制SIRT1減弱了蝦青素對心肌纖維化的抑制作用:Masson染色、α-SMA及COLⅠ的免疫組化均顯示與TAC+AST組相比,TAC+AST+EX-527組中纖維化明顯增加(P0.05),在所有分組里邊,TAC+EX-527組中的纖維化程度最高(P0.01)。TGF-β、α-SMA及COLⅠ的蛋白表達(dá)水平檢測也顯示抑制SIRT1減弱了蝦青素的抗纖維化作用(P0.05)。1.5各組心肌中R-SMADs磷酸化及乙酰化水平的改變:與SHAM組相比,TAC組中R-SMADs的磷酸化及乙�；蕉济黠@升高(均P0.05),TAC+AST組中未見明顯升高(P0.05),而抑制SIRT1后,只有ac-SMADs的水平升高(P0.05),磷酸化水平變化不明顯(均P0.05)。1.6 R-SMADs的核轉(zhuǎn)位改變:與SHAM組相比,TAC組中R-SMADs多分布于胞核,TAC+AST組中則更多地定位在胞漿,而在TAC+AST+EX-527組中,抑制SIRT1后R-SMADs的分布較TAC+AST組沒有明顯變化。2、細(xì)胞實驗2.1 TGF-β1刺激心肌成纖維細(xì)胞分化的濃度選擇及對SIRT1的影響:根據(jù)α-SMA表達(dá)水平來看,在TGF-β11Ong/ml刺激24小時后,α-SMA表達(dá)水平明顯升高(P0.01),證明1Ong/ml濃度能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化;同時SIRT1的表達(dá)及活性均明顯降低(P0.01)。2.2蝦青素對心肌成纖維細(xì)胞中SIRT1的影響:經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)預(yù)處理后,蝦青素濃度為80μmol/ml時,α-SMA及COLⅠ表達(dá)減少(P0.05),同時SIRT1表達(dá)水平及活性明顯升高(P0.05);在無TGF-β1刺激的細(xì)胞中,各濃度AST對SIRT1的表達(dá)沒有影響(P0.05),而濃度在40μmol/ml時,SIRT1的活性已出現(xiàn)較明顯增強(qiáng)(P0.05)。2.3干擾SIRT1對蝦青素在細(xì)胞中作用的影響:與TGF-β1+AST組相比,SIRT1被干擾后,α-SMA及COLⅠ表達(dá)增加(P0.05)。SIRT1與α-SMA在細(xì)胞免疫熒光染色中的變化趨勢與蛋白水平變化相同。2.4心肌成纖維細(xì)胞中R-SMADs磷酸化及乙�；阶兓�:與空白對照組相比,TGF-β1刺激使SMAD2及SMAD3的磷酸化及乙酰化水平明顯增高(P0.05);與TGF-β1組相比,蝦青素處理后,SMAD2和SMAD3的兩種修飾水平明顯降低(P0.05);而在SIRT1被干擾后,蝦青素對乙�；降淖饔脺p弱,對磷酸化水平的作用沒有明顯改變(P0.05)。2.5心肌成纖維細(xì)胞中R-SMADs的核轉(zhuǎn)位改變:與對照組相比,TGF-β1刺激促進(jìn)了 SMAD2和SMAD3向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,而蝦青素抑制了它們的核轉(zhuǎn)位,干擾SIRT1后,蝦青素仍然能夠抑制R-SMADs向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。與核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象一致的是,TGF-β1刺激使受體TβR Ⅰ和TβRⅡ轉(zhuǎn)錄水平升高,不論SIRT1是否被抑制,蝦青素都能抑制它們的升高(P0.05)。2.6 SMAD3的轉(zhuǎn)錄活性變化:與對照組相比,TGF-β1能增強(qiáng)SMAD3的轉(zhuǎn)錄活性,而蝦青素能抑制這種增強(qiáng),干擾SIRT1后,抑制作用減弱,SMAD3轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)。結(jié)論1、蝦青素通過抑制R-SMADs的磷酸化及乙酰化水平抑制后負(fù)荷增高導(dǎo)致的心肌纖維化及TGF-β1誘導(dǎo)的人心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化;2、心臟后負(fù)荷增高或TGF-β1刺激能降低心肌或細(xì)胞中的SIRT1水平及活性,而蝦青素能抑制SIRT1水平及活性的降低;3、SIRT1只參與了蝦青素影響R-SMADs乙�；倪^程,而沒有參與蝦青素影響磷酸化的過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1292388