本文關(guān)鍵詞：益氣活血方基于Notch信號(hào)調(diào)控心肌梗死后心肌重構(gòu)作用機(jī)理的研究

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【摘要】：背景與目的:心血管疾病已成為我國的重大公共衛(wèi)生問題,其中急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率呈快速上升態(tài)勢(shì),經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)是急性心肌梗死的重要治療方法,可以有效降低死亡率和再發(fā)梗死率,但是隊(duì)列研究顯示單純接受PCI患者的預(yù)后獲益并不優(yōu)于強(qiáng)化藥物治療的患者,且PCI不僅帶來了冠脈微循環(huán)障礙,也帶來了不同程度的心肌重構(gòu),這就提醒我們需要更加關(guān)注冠脈微循環(huán)障礙與心肌重構(gòu),努力撥慢心肌梗死后心力衰竭進(jìn)展的時(shí)鐘,改善患者的預(yù)后。線粒體損傷是心肌重構(gòu)發(fā)生與進(jìn)展的關(guān)鍵因素,線粒體能量代謝障礙、結(jié)構(gòu)功能破壞是多種線粒體損傷形式的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此關(guān)注線粒體損傷,關(guān)注線粒體能量代謝、線粒體結(jié)構(gòu)與功能,改善心肌缺血和防治心肌重構(gòu),對(duì)于預(yù)防與改善心肌梗死后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)有重要意義。Notch及AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路可以從多角度對(duì)線粒體能量代謝進(jìn)行調(diào)控,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能,有望成為臨床藥物研究與開發(fā)的新靶點(diǎn)。依據(jù)中醫(yī)氣血理論創(chuàng)立的益氣活血方是臨床常用治療心肌缺血的經(jīng)驗(yàn)方,具有益氣養(yǎng)心,活血通脈的功效。前期研究顯示本方可以有效減輕心肌梗死患者的臨床癥狀、增強(qiáng)心臟收縮功能,改善冠脈微循環(huán)障礙。因此,本研究將從調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的角度,以Notch及AMPK信號(hào)通路為橋梁,觀察益氣活血方防治心肌重構(gòu)的作用機(jī)制。方法:結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制心肌梗死動(dòng)物模型,術(shù)后第2天予以相關(guān)藥物干預(yù),觀察7天、28天兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)變化情況。本研究分為四個(gè)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)一、二、三隨機(jī)將造模成功大鼠分為心肌梗死組、益氣活血方組、培哚普利組、DAPT(γ分泌酶抑制劑,Notch信號(hào)抑制劑)組、Notch抑制劑+益氣活血方組,并設(shè)置假手術(shù)組。運(yùn)用超聲心動(dòng)觀察各時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能變化,運(yùn)用HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,以評(píng)價(jià)各組大鼠成模情況及左心室重塑程度。通過蛋白印跡法及實(shí)時(shí)熒光定量法分別檢測(cè)Notch,AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá),觀察Notch及AMPK信號(hào)通路交叉對(duì)話關(guān)系,揭示該交叉對(duì)話在心肌梗死后心肌重構(gòu)中的作用。運(yùn)用ELISA檢測(cè)大鼠血糖及游離脂肪酸變化,運(yùn)用蛋白印跡法檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)及乙酰輔酶A羧化酶(ACC)蛋白表達(dá),揭示益氣活血方提高Notch1和AMPK交叉對(duì)話,通過不同作用機(jī)制動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠糖脂代謝,改善線粒體能量障礙。實(shí)驗(yàn)四將造模成功大鼠隨機(jī)分為心肌梗死組、益氣活血方組、培哚普利組,并設(shè)置假手術(shù)組。運(yùn)用透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)過氧化物酶增殖激活受體Y輔助激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)蛋白表達(dá)變化;運(yùn)用熒光酶標(biāo)法檢測(cè)ATP合成情況,揭示益氣活血方保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能,從而促進(jìn)ATP合成,以發(fā)揮心肌保護(hù)作用。結(jié)果:(1)心臟結(jié)構(gòu)和功能:心肌梗死組大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸率(LVFS)明顯下降,左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)明顯增加(Pall0.01)。7天時(shí),與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組和培哚普利組LVEF、LVFS升高(Pall0.05),LVIDs、LVIDd、EDV、ESV縮減,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pall0.05),Notch抑制劑組LVEF明顯下降(P0.01),LVFS率下降,LVIDs、LVIDd、EDV、ESV增加,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組LVEF、LVFS下降(Pall0.05),LVIDs縮減、LVIDd、EDV、ESV增加,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pall0.05)。28天時(shí),與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組LVEF、LVFS升高、EDV、ESV縮減(Pall0.05),培哚普利組LVEF、LVFS升高,EDV、ESV縮減,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pall0.05),益氣活血方組與培哚普利組LVIDs、LVIDd縮減(Pall0.01),Notch抑制劑組LVEF、LVFS明顯下降,LVIDs、LVIDd、EDV增加(p0.05),ESV增加,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組LVEF、LVFS降低,LVIDs、LVIDd、ESV增加(Pall0.01),EDV增加,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果表明,心肌梗死后,心臟收縮功能下降,心室重塑明顯,運(yùn)用益氣活血方可以改善心臟收縮功能,減輕心室重塑程度。(2)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué):假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊,紋理清晰,偶有斷裂,心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤;7天時(shí),心肌梗死組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，，紋理走向不確定,可見灶性心肌纖維走形中斷,心肌細(xì)胞核溶解、消失,大量炎性細(xì)胞浸潤。28天時(shí),心肌梗死組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,紋理走向不確定,可見大量灶性心肌纖維走形中斷,大量纖維及膠原組織增生。益氣活血方組和培哚普利組大鼠心肌細(xì)胞增生明顯,重新排列較規(guī)整,部分纖維及膠原組織增生,較心肌梗死組病變范圍減小。Notch抑制劑組心肌細(xì)胞排列紊亂,紋理走向不確定,可見大量灶性心肌纖維走形中斷,纖維及膠原組織增生較心肌梗死組擴(kuò)大,Notch抑制劑+益氣活血方組病理改變與Notch抑制劑組相似,但纖維及膠原組織增生較其減輕。表明心肌梗死后,心肌細(xì)胞形態(tài)破壞明顯,運(yùn)用益氣活血方可以有效減輕心肌細(xì)胞形態(tài)破壞。(3)Notch和AMPK信號(hào)通路交叉對(duì)話:7天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達(dá)下降(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組和培哚普利組 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表達(dá)升高(Pall0.05),Notch 抑制劑組 Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達(dá)下降(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組Notch、pAMPK蛋白表達(dá)下降(Pall0.01),pLKB1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P=0.056)。28天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達(dá)下降(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組和培哚普利組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達(dá)升高(Pall0.01),Notch 抑制劑組 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表達(dá)下降(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達(dá)下降(Pall0.01),表明Notch與AMPK信號(hào)通路間存在交叉對(duì)話,心肌梗死后,Notch和AMPK信號(hào)蛋白表達(dá)下降,運(yùn)用益氣活血方可以增加Notch和AMPK信號(hào)蛋白表達(dá)。(4)心肌細(xì)胞能量代謝:7天時(shí),與假手術(shù)組大鼠相比,心肌梗死組大鼠血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組與培哚普利組血糖、游離脂肪酸下降(Pall0.01),Notch抑制劑組血糖、游離脂肪酸升高,但無明顯統(tǒng)計(jì)意義(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。28天時(shí),與假手術(shù)組大鼠相比,心肌梗死組大鼠血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.01)。與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組血糖、游離脂肪酸降低(Pall0.05),培哚普利組血糖降低,但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.252),游離脂肪酸降低明顯(P0.01),Notch抑制劑組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。Notch抑制劑+益氣活血方組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.01)。7天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組GLUT4,pACC蛋白表達(dá)下降(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組GLUT4蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.(Pall0.05),pACC蛋白表達(dá)升高(Pall0.05),Notch抑制劑組GLUT4蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),pACC蛋白表達(dá)降低(P=0.004)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組GLUT4蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),pACC蛋白表達(dá)降低(P=0.027)。28天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組GLUT4,pACC蛋白表達(dá)下降(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組GLUT4蛋白表達(dá)升高(Pall0.05),pACC蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pall0.05),Notch抑制劑組GLUT4蛋白表達(dá)降低(P=0.034),pACC蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組GLUT4蛋白表達(dá)降低(P=0.047),pACC蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì),但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。各組ACC蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明心肌梗死后,糖脂代謝紊亂,益氣活血方可以調(diào)節(jié)糖脂代謝,改善線粒體能量代謝障礙。(5)線粒體結(jié)構(gòu)、功能與ATP合成:假手術(shù)組心肌纖維排列整齊且緊密,橫紋清晰可見,肌小節(jié)完整,線粒體形態(tài)正常,膜完整,嵴清晰;7天時(shí),心肌梗死組心肌細(xì)胞肌絲排列嚴(yán)重紊亂肌纖維走形不規(guī)則、斷裂,可見肌原纖維溶解消失,線粒體形態(tài)大小不等,部分空泡化明顯,界膜破裂,嵴模糊不清,嵴間基質(zhì)密度增高。28天時(shí),心肌梗死組心肌細(xì)胞肌絲排列嚴(yán)重紊亂,肌纖維走形不規(guī)則、斷裂,可見膠原纖維及組織增殖,肌絲斷裂處可見線粒體聚集,形態(tài)大小不等,嵴模糊不清,嵴間基質(zhì)密度增高。7天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達(dá)量顯著減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組PGC-1 α、NRF1、mtTFA蛋白表達(dá)呈增多(Pall0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。28天時(shí),與假手術(shù)組相比,心肌梗死組大鼠PGC-1α蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P=0.111),NRF1、mtTFA表達(dá)量顯著減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達(dá)呈增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pall0.05)。表明心肌梗死后,線粒體結(jié)構(gòu)破壞,線粒體生物合成功能下降,益氣活血方可以改善線粒體結(jié)構(gòu),并通過AMPK信號(hào)通路促進(jìn)了心肌線粒體的生物合成。結(jié)論:1.益氣活血方可有效改善心肌梗死大鼠心臟收縮功能,減輕心室重塑程度;2.益氣活血方能夠調(diào)節(jié)心肌梗死后糖脂代謝,改善心肌細(xì)胞線粒體能量代謝障礙,其作用可能與提高Notch信號(hào)通路與AMPK信號(hào)通路交叉對(duì)話的調(diào)控有關(guān);3.益氣活血方可以保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能,促進(jìn)ATP合成,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：1291515