本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞調(diào)控心梗后交感神經(jīng)再生的作用和分子機(jī)制

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【摘要】：研究背景心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)是MI的常見并發(fā)癥,每年每10萬人中平均有0.46-3.7人死于SCD。在臨床實(shí)踐中,在MI早期,患者易反復(fù)發(fā)作室速(VT)、室顫(VF),亦稱為"交感電風(fēng)暴",其發(fā)生與交感神經(jīng)過度增生和激活密切相關(guān),盡管抗心律失常藥物胺碘酮、ICD植入術(shù)和射頻消融術(shù)在MI后電風(fēng)暴中廣泛應(yīng)用,仍存在心律失常反復(fù)、不能終止的現(xiàn)象。在犬類及嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,針對交感神經(jīng)的左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)阻滯、腎交感神經(jīng)切除術(shù)及迷走神經(jīng)刺激術(shù)在改善MI后室性心律失常發(fā)作中效果顯著,但臨床樣本少、缺乏有力證據(jù)。目前,交感神經(jīng)過度增生為特點(diǎn)的心臟自主神經(jīng)重構(gòu)成為MI早期VT、VF發(fā)作的重要元素,所以,探討MI后交感神經(jīng)過度增生的分子機(jī)制可為臨床MI后惡性心律失常的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)在外周神經(jīng)損傷和再生中起到重要作用。這一發(fā)現(xiàn)為自主神經(jīng)重構(gòu)的防治打開了新的視窗。炎癥介導(dǎo)的心肌梗死(MI)周邊交感神經(jīng)增生與心律失常致心源性猝死的發(fā)病緊密相關(guān),有研究表明,MI處浸潤的巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生神經(jīng)生長因子(NGF)成為連接炎癥反應(yīng)和交感神經(jīng)再生的紐帶,但具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞調(diào)控NGF的機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞主要分為促炎的M1型和抑炎的M2型。在對于MI后心肌重構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞的表型和功能連續(xù)變化。在MI急性炎癥期,M1型巨噬細(xì)胞大量浸潤,并在MI3天達(dá)到高峰;5天后,M2型巨噬細(xì)胞逐漸增多,并于MI7天達(dá)高峰,此后巨噬細(xì)胞逐漸消退。進(jìn)一步探尋MI后調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型和功能的上游分子可為心梗后自主神經(jīng)重構(gòu)。Notch信號(hào)在MI后炎癥細(xì)胞中過度激活,同時(shí)Xu等在Nature communication中的最新研究發(fā)現(xiàn),Notch可調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變,參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)控,但其在MI后交感神經(jīng)重構(gòu)中的作用未有報(bào)道。因此我們猜測,Notch信號(hào)的激活參與MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,這一過程可通過影響NGF的釋放參與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的調(diào)控過程。研究目的我們旨在探究Notch信號(hào)在MI后的激活狀態(tài),Notch信號(hào)對MI后巨噬細(xì)胞及其主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響,最終探討Notch信號(hào)對心臟交感神經(jīng)再生的影響和機(jī)制。研究方法流程一實(shí)驗(yàn)大鼠分為以下四組:Ⅰ,假手術(shù)+DMSO組:予大鼠冠狀動(dòng)脈前降支穿線不結(jié)扎,DMSO尾靜脈注射,每次劑量50ul,造模前半小時(shí)首次注射,后每天一次直至取材;Ⅱ,假手術(shù)+ DAPT 組(N-N-(3,5-difluorophenacetyl-1-alanyl)-S-phenylglycine-t-butyl ester):手術(shù)及DAPT注射方法同組Ⅰ,DAPT單次劑量10mg/kg,溶于50ulDMSO中;Ⅲ,MI+DAPT組:予大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘發(fā)MI,DAPT注射及頻次同前,注射方法同組Ⅱ;Ⅳ,MI+DMSO組:MI造模及DMSO注射方法同組Ⅲ。MI后三天,分離心肌梗死區(qū)巨噬細(xì)胞,梗死區(qū)心肌,梗死灶周心肌,梗死遠(yuǎn)端心肌及空白心肌行RT-PCR檢測Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白(NICD1、Hes1)的mRNA表達(dá);同時(shí)采用免疫熒光和Western blot分別定位和定量梗死心臟NICD1的表達(dá),同時(shí)行CD68、CD163及CD68、Arg1熒光雙染及RT-PCR判定巨噬細(xì)胞表型;Elisa檢測血漿中TNF-α,IL-1β的水平。MI后7天,利用心室壓力容積系統(tǒng)測定血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài);程序性電刺激測定心律失常易感性;采用酪氨酸羥化酶(TH)、生長相關(guān)蛋白43(GAP43)熒光染色半定量分析心臟交感神經(jīng)再生。流程二為分析DAPT對NGF的作用,我們將MI大鼠分為:Ⅰ,MI組:方法同上;Ⅱ,MI+DAPT 低劑量組(5mg/kg);Ⅲ,MI+DAPT 高劑量組(1Omg/kg),7天后取材,RT-PCR和Western Blot測定梗死區(qū)和梗死灶周NGF的mRNA和蛋白水平;利用CD68和NGF熒光雙染判定表達(dá)NGF的巨噬細(xì)胞比例。流程三體外實(shí)驗(yàn):提取大鼠骨髓巨噬細(xì)胞,在加入NGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天,后隨機(jī)分為:空白組、LPS(10μg/ml)+IFN-γ(20ng/ml)組、LPS(10μg/ml)+IFN-γ(20 ng/ml)+DAPT(10 μg/ml)組;空白組、IL-4(10 ng/ml)組、IL-4+DAPT組。研究結(jié)果1、同巨噬細(xì)胞極化的時(shí)間窗一致,Notch信號(hào)相關(guān)蛋白NICD1和Hesl在MI3天顯著激活,至MI7天表達(dá)回落至與正常水平相當(dāng)。RT-PCR和免疫熒光雙染定量和定位Notch信號(hào)的激活。Notch信號(hào)在巨噬細(xì)胞中顯著激活,在梗死心臟中主要與CD68陽性的巨噬細(xì)胞共染,而非心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。2、MI早期應(yīng)用Notch信號(hào)阻斷劑DAPT減少梗死區(qū)巨噬細(xì)胞的募集,降低血漿中TNF-α,IL-1β的水平,同時(shí)增加MI早期M2型巨噬細(xì)胞的比例,并以劑量依賴型的方式減少NGF的合成;最終,免疫熒光顯示,DAPT降低MI7天TH、GAP43陽性的交感神經(jīng)纖維數(shù)目,改善交感神經(jīng)重構(gòu)。與此一致,程序性電刺激得到的心律失常評分示,DAPT干預(yù)的MI大鼠室性心律失常易感性明顯降低。此外,血流動(dòng)力學(xué)檢測和Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),DAPT干預(yù)會(huì)導(dǎo)致心功能惡化、心梗面積擴(kuò)大。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LPS/IFN-γ以Notch依賴的方式上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞NGF的表達(dá)。3、體外BMM實(shí)驗(yàn)指出,抑制Notch信號(hào)改變M1型巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài),并以Notch信號(hào)依賴的方式減少LPS/IFN-y誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞中NGF的產(chǎn)生,相反,其對M2型巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和NGF的合成無影響。研究結(jié)論在大鼠MI模型中,我們證明Notch信號(hào)MI的急性炎癥期在巨噬細(xì)胞中過度激活,并參與MI后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控。抑制Notch信號(hào)使巨噬細(xì)胞早期向M2型轉(zhuǎn)換,下調(diào)NGF的表達(dá),最終改善MI后交感神經(jīng)過度增生。研究結(jié)果提示Notch信號(hào)可能是通過巨噬細(xì)胞依賴途徑,參與MI后交感神經(jīng)重構(gòu),這一發(fā)現(xiàn)為心梗后室性心律失常的防治提供了新的靶點(diǎn)。研究背景目前,炎癥反應(yīng)在MI后自主神經(jīng)重構(gòu)中的作用已被廣泛證實(shí),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,多種抗炎藥物、及包括NF-kB、PPAR-γ在內(nèi)的炎癥信號(hào)的阻斷劑均具有改善MI后自主神經(jīng)重構(gòu)的作用,但直接將炎癥反應(yīng)和MI后神經(jīng)再生的"紐帶"仍不明確。直至09年,WernliG等人發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞通過大量合成NGF成為聯(lián)系炎癥反應(yīng)和交感神經(jīng)增生的重要紐帶:他們通過膦酸二鈉脂質(zhì)體藥物敲除巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn),MI后浸潤在梗死心肌中的分泌神經(jīng)生長因子(NGF)的主要來源。第-部分實(shí)驗(yàn)中,我們通過調(diào)控Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞表型,發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2方向轉(zhuǎn)化的同時(shí)NGF產(chǎn)生減少,交感神經(jīng)重構(gòu)得以改善,間接說明了 M1型巨噬細(xì)胞在MI后交感神經(jīng)中的作用。但或許阻斷Notch信號(hào)過早的使巨噬細(xì)胞向M2方向極化,導(dǎo)致MI 7天心律失常易感性明顯改善的同時(shí),心功能顯著惡化。明確M1型巨噬細(xì)胞—NGF的作用后,我們繼續(xù)尋找調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞合成NGF的上游分子靶點(diǎn)。M1型巨噬細(xì)胞以分泌IL-1β在內(nèi)的多種炎癥細(xì)胞為特點(diǎn)。以IL-1β為代表的促炎性細(xì)胞因子通過調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)在糖尿病外周神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜神經(jīng)病變等疾病中成為研究熱點(diǎn)。有研究指出,組織巨噬細(xì)胞IL-1β的成熟與分泌完全依賴于P2X7R信號(hào)。在缺氧、細(xì)胞損傷及機(jī)械應(yīng)力等刺激下,大量ATP會(huì)釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中,激活P2X7R,改變細(xì)胞破壞/損傷處的免疫反應(yīng)。P2X7R是以三磷酸腺苷(ATP)為配體的非選擇性陽離子門控通道(K+、Na+、Ca2+等),主要選擇性的表達(dá)在造血源性細(xì)胞,如單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞中。它在炎癥反應(yīng)中主要通過M1型巨噬細(xì)胞IL-1β的產(chǎn)生發(fā)揮作用,在M2型巨噬細(xì)胞中功能學(xué)意義較小,對表型改變不大。我們前期實(shí)驗(yàn)表明,巨噬細(xì)胞分泌NGF和炎癥因子調(diào)控MI后交感神經(jīng)再生。髓系P2X7信號(hào)通過激活NOD樣受體(NLRP3),介導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞IL-1β的切割成熟和分泌。但其在NGF分泌及交感神經(jīng)再生中的作用未有研究。研究目的我們旨在探討A-740003,一種P2X7R拮抗劑,是否參與MI后炎性反應(yīng)和交感神經(jīng)再生;并探討NLRP3/IL-1β通路是否參與這一過程。研究方法流程一為了在體研究P2X7R和IL-1β的關(guān)系,我們將25只大鼠隨機(jī)分為4組:Ⅰ,空白(Naive)組;Ⅱ,內(nèi)毒素(LPS)組:LPS 2 mg/kg稀釋到生理鹽水中一次性腹腔注射;Ⅲ,LPS+BzATP組:LPS方法劑量同前,注射后3小時(shí),BzATP,P2X7R 激動(dòng)劑,50μg/5μL;LPS + BzATP + NLRP3 抑制劑組:BzATP和LPS劑量方法同前,NLRP3抑制劑16673-34-0(100 mg/kg稀釋在0.05 ml生理鹽水中)在LPS注射前30分鐘皮下注射。LPS注射后6小時(shí)取心臟左室,對 P2X7R、NLRP3、caspase-1、IL-1β 行蛋白定量 Western Blot 檢測。流程二為了研究P2X7R和IL-1β在MI后的動(dòng)態(tài)變化,我們將27只MI大鼠按取材時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為以下6組:MI-0d,MI后立即取材;MI-0.5d,MI后半天取材;MI-1d,MI后1天取材;MI-3d,MI后3天取材;MI-5d,MI后5天取材;MI-7d,MI后7天取材。取不同時(shí)間點(diǎn)的梗死心肌行P2X7R,NLRP3和IL-1β的 Western Blot 檢測。流程三為了研究P2X7R和IL-1β在MI后交感神經(jīng)重構(gòu)中的作用和機(jī)制,我們將大鼠隨機(jī)分為以下幾組:Ⅰ,假手術(shù)組(n =15);Ⅱ,MI組(n =28):造模方法同第一部分;Ⅲ,MI + A-740003組(n =28):A-740003 50 mg/kg溶解在生理鹽水中并于MI前一天腹腔注射,每天一次直至第七天取材;Ⅳ,MI+Anakinra組(n =30):2 mg/kg大鼠重組IL-1R拮抗劑(Anakinra)溶解在0.67ml 0.9%的氯化鈉中,術(shù)后即刻皮下注射,每天一次直至第七天取材;V,MI +A-740003+Anakinra組(n =28):A-740003、Anakinra劑量、給藥方式同前。于MI后3天和7天取材。MI3天取左室梗死灶周區(qū)域行Western blot檢測P2X7信號(hào)相關(guān)蛋白P2X7R、NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達(dá);MI7天取材前用心室壓力容積系統(tǒng)行血流動(dòng)力學(xué)檢測,后開胸行程序性電刺激檢測大鼠室性心律失常易感性;取梗死灶周組織行CD68抗體的免疫組化檢測巨噬細(xì)胞的浸潤,行梗死灶周CD68和NGF的免疫熒光雙染半定量合成NGF的巨噬細(xì)胞比例,行Western blot檢測梗死灶周NGF總蛋白水平。最后,我們行酪氨酸羥化酶(TH)和生長相關(guān)蛋白-43(GAP43)的免疫熒光染色評價(jià)MI后交感神經(jīng)再生程度。研究結(jié)果1、在注射LPS大鼠的左室中,Western Blot示LPS可明顯增加NLRP3的表達(dá)水平,但切割caspase-1和成熟IL-1β的表達(dá)并未顯著增加;LPS刺激基礎(chǔ)上予以P2X7R激動(dòng)劑BzATP可誘發(fā)caspase-1的激活和成熟IL-1β的釋放,這一過程被NLRP3抑制劑(16673-34-0)阻斷。2、MI模型大鼠的左室中,免疫熒光半定量示P2X7R主要與梗死心肌中浸潤的巨噬細(xì)胞共染;Western Blot示P2X7-NLRP3炎癥體和IL-1β顯著激活,P2X7R抑制劑A-740003阻斷NLRP3/IL-1β的激活。免疫組化示A-740003和/或Anakinra明顯減少巨噬細(xì)胞的浸潤,并減少NGF陽性的巨噬細(xì)胞數(shù)目,降低NGF的蛋白水平。TH和GAP43熒光半定量示,A-740003和/或Anakinra阻斷交感神經(jīng)的過度增生。其中,A-740003和A-740003 + Anakinra處理組交感神經(jīng)增生減少的水平相當(dāng),Anakinra處理組對交感神經(jīng)增生減弱的幅度較前兩者略弱,間接提示P2X7信號(hào)介導(dǎo)MI交感神經(jīng)再生的病理過程部分通過IL-1β發(fā)揮作用;此外,血流動(dòng)力學(xué)和Masson染色結(jié)果提示,阻斷P2X7通路可明顯改善心功能,降低梗死面積。3、體外實(shí)驗(yàn)中,免疫熒光雙染示,P2X7R在M1和M2型巨噬細(xì)胞中均明顯激活。Western blot示BzATP刺激進(jìn)一步增加M1型巨噬細(xì)胞中NGF和IL-1β的表達(dá),這一過程被IL-1β阻斷劑Anakinra阻斷;相反,在M2型巨噬細(xì)胞中,P2X7R的激活不能引起IL-1β和NGF表達(dá)的增加。研究結(jié)論我們的數(shù)據(jù)表明P2X7R通過IL-1β增加M1型巨噬細(xì)胞中NGF的表達(dá);藥物阻斷P2X7R可以通過抑制NLRP3/IL-1β通路減輕MI后交感神經(jīng)再生程度,從而進(jìn)一步減輕MI后室性心律失常的發(fā)生。同時(shí),P2X7R阻斷劑改善MI后心功能。這為臨床改善MI預(yù)后提供了新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R542.22
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本文編號(hào)：1291523