本文關(guān)鍵詞：小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞通過mGluR4影響B(tài)16細(xì)胞黑素合成及姜黃素的作用機(jī)制研究

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【摘要】：一、目的與意義白癜風(fēng)是一種常見的獲得性、進(jìn)展性的色素脫失性皮膚病,全世界發(fā)病率約為0.5%~1%。發(fā)病機(jī)制理論主要包括氧化應(yīng)激學(xué)說、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說、遺傳學(xué)說、黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說、自身免疫學(xué)說等。諸多研究證實(shí)免疫學(xué)機(jī)制在白癜風(fēng)的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前的治療方法主要有外用糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、光療和手術(shù)移植等。然而對于泛發(fā)型等難治性白癜風(fēng),尚無有效的治療手段。深入研究白癜風(fēng)的免疫發(fā)病機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上開發(fā)生物靶向藥物,對于提高該皮膚頑癥的治愈率具有重要的臨床意義。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群,可特征性的分泌白介素17(interleukin 17,IL-17)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,能通過提供抗原、共刺激和細(xì)胞因子(如IL-6、IL-23等)信號促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。維甲酸相關(guān)孤核受體γt(retinoic acid-related organ receptorsγt,RORγt)是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化所必需的譜系限制性轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞在對真菌和細(xì)胞外細(xì)菌的免疫防御中起關(guān)鍵作用,但也參與許多自身免疫性疾病的病理過程。目前普遍認(rèn)為非節(jié)段型白癜風(fēng)的主要發(fā)病機(jī)制是免疫學(xué)異常。新近研究表明白癜風(fēng)患者系統(tǒng)、組織和細(xì)胞的IL-17表達(dá)水平增加,且皮損處網(wǎng)狀真皮層出現(xiàn)Th17細(xì)胞浸潤。并有研究發(fā)現(xiàn)IL-17表達(dá)水平和白癜風(fēng)疾病的活動性、皮損范圍和嚴(yán)重性之間存在顯著正相關(guān)性。上述研究提示Th17細(xì)胞在白癜風(fēng)免疫發(fā)病過程中的重要作用,而具體的機(jī)制尚未完全明確。代謝型谷氨酸受體4(metabotropic glutamate receptor 4,mGluR4)屬于III組代謝型谷氨酸受體的成員,是主要位于神經(jīng)元突觸前的一種受體,其功能是調(diào)節(jié)谷氨酸(作為自身受體)或GABA(作為異受體)的釋放。在帕金森病、焦慮、抑郁癥、慢性疼痛等疾病的治療中,激活mGluR4已經(jīng)成為一種前景廣闊的治療方法。近年來關(guān)于谷氨酸信號通路在非神經(jīng)系統(tǒng),如皮膚組織和免疫系統(tǒng)等中的研究逐漸成為學(xué)者們探討的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸受體在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá),如T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC以及巨噬細(xì)胞等。但該通路對免疫細(xì)胞具體功能的影響及其相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。近年來Francesca Fallarino等報(bào)道,mGluR4敲除的小鼠更易發(fā)生實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalo-myelitis,EAE),并啟動Th17免疫應(yīng)答;而野生型小鼠經(jīng)PHCCC(mGluR4的選擇性增強(qiáng)劑)治療后,可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)發(fā)育,抑制Th17免疫應(yīng)答而產(chǎn)生EAE抗性。這些結(jié)果表明mGluR4可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫,并且抑制神經(jīng)炎癥。近期研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性因素可能誘發(fā)多種皮膚疾病或者加速皮膚疾病進(jìn)展。從解剖學(xué)角度看,神經(jīng)細(xì)胞與黑素細(xì)胞共同起源于胚胎外胚層的神經(jīng)嵴。此外,神經(jīng)系統(tǒng)參與許多皮膚組織的生理病理過程,在皮膚屏障功能和皮膚炎癥免疫等方面發(fā)揮著重要作用。因此在皮膚水平,基于神經(jīng)和免疫系統(tǒng)之間功能交叉的創(chuàng)新概念逐漸興起。然而,目前國內(nèi)外尚未報(bào)道關(guān)于谷氨酸信號通路在白癜風(fēng)免疫發(fā)病機(jī)制中的研究。綜上所述,我們選擇mGluR4作為神經(jīng)、免疫、皮膚網(wǎng)絡(luò)中多系統(tǒng)動態(tài)作用的關(guān)鍵媒介,來研究白癜風(fēng)發(fā)病過程中的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明Th17細(xì)胞在白癜風(fēng)免疫發(fā)病機(jī)制中的作用,并為開發(fā)以相關(guān)的蛋白、基因?yàn)榘形坏纳锇邢蛩幬锾峁⿲?shí)驗(yàn)依據(jù)。姜黃素是姜黃的主要生物活性成分,能有效的抗炎、抗氧化和抗腫瘤。近來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以治療多種自身免疫性疾病(如關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化等)。聯(lián)合應(yīng)用UVB光療和四氫類姜黃素(源自姜黃素類化合物)治療白癜風(fēng)效果優(yōu)于單用UVB光療。姜黃素還能夠減少同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖,并顯著抑制Th17細(xì)胞分化。目前,姜黃素調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的確切機(jī)制尚未完善。前期研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可以誘導(dǎo)人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和C8161自噬、并抑制細(xì)胞增殖和侵襲,可能與蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信號通路抑制有關(guān)。姜黃素還可通過抑制促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路而抑制DC成熟。mGluR4活化能刺激MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/AKT信號通路。然而目前國內(nèi)外尚未報(bào)道關(guān)于姜黃素與mGluR4信號通路的研究。因此,我們研究了姜黃素對Th17細(xì)胞分化的影響,并初步探討了該作用機(jī)制是否與mGluR4信號通路相關(guān),為姜黃素治療白癜風(fēng)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)方法1、從4~8周C57小鼠股骨、脛骨中分離、提取DC前體細(xì)胞。加入粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)及IL-4誘導(dǎo)其分化為未成熟DC,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)孵育48 h刺激其成熟。每天在倒置顯微鏡下觀察骨髓源性樹突狀細(xì)胞(bone marrow derived-dentritic cells,BMDC)形態(tài),并拍照。2、在透射電鏡下觀察BMDC的超微結(jié)構(gòu),并以流式細(xì)胞儀檢測BMDC表面標(biāo)記物CD11c、CD80、CD86、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(major histocompatibility complex class II,MHC II)的表達(dá)。3、采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、實(shí)時熒光定量PCR(Real time Quantitative PCR,q PCR)及western blot法檢測BMDC表面mGluR4的表達(dá)。4、用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將mGluR4小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染入小鼠BMDC,下調(diào)mGluR4表達(dá),采用q PCR、western blot方法檢測敲減效率。5、用密度梯度離心法分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,并進(jìn)行CD4+T細(xì)胞免疫磁珠分選。將小鼠BMDC以不同比例與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),采用CCK-8法檢測BMDC促進(jìn)與其共培養(yǎng)T細(xì)胞增殖的能力。6、采用q PCR方法檢測mGluR4基因敲減對小鼠BMDC IL-6、IL-23 m RNA水平,以及與BMDC共培養(yǎng)體系中IL-17A、RORγt m RNA水平的影響。7、將mGluR4基因敲減的小鼠BMDC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),以其培養(yǎng)基上清刺激小鼠B16細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察對細(xì)胞形態(tài)的影響,并拍照。8、將mGluR4基因敲減的小鼠BMDC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),以其培養(yǎng)基上清刺激小鼠B16細(xì)胞,采用q PCR方法檢測小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmiaassociated transcription factor,MITF)、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(tyrosinase related protein 1,TRP-1)等基因m RNA水平的變化。9、將mGluR4基因敲減的小鼠BMDC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),以其培養(yǎng)基上清刺激小鼠B16細(xì)胞,檢測對B16細(xì)胞黑素合成和TYR活性的影響。10、用不同濃度姜黃素處理BMDC,用CCK-8法檢測對細(xì)胞活性及BMDC促進(jìn)共培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞增殖能力的影響。11、用q PCR方法檢測姜黃素對小鼠BMDC IL-6、IL-23 m RNA水平,以及與BMDC共培養(yǎng)體系中IL-17A、RORγt m RNA水平的影響。12、采用q PCR及western blot法檢測姜黃素對BMDC表面mGluR4表達(dá)的影響。三、結(jié)果(一)BMDC表面mGluR4下調(diào)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化1、原代培養(yǎng)的小鼠BMDC倒置顯微鏡和透射電鏡鏡下觀察,均符合DC的典型形態(tài)。流式結(jié)果顯示MHC-II+CD11c+細(xì)胞比例在80%以上,細(xì)胞純度較高,CD80+、CD86+、MHC-II+細(xì)胞比例均顯著高于未成熟組。上述結(jié)果提示小鼠BMDC培養(yǎng)成功,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。2、檢測到mGluR4在小鼠BMDC表面表達(dá)。3、si RNA轉(zhuǎn)染成功下調(diào)小鼠BMDC表面mGluR4的表達(dá)。4、下調(diào)mGluR4提高小鼠BMDC的IL-6、IL-23 m RNA水平。5、下調(diào)mGluR4提高小鼠BMDC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖的能力,并增加與BMDC共培養(yǎng)體系中IL-17A、RORγt的m RNA水平。(二)BMDC表面mGluR4下調(diào)影響小鼠B16細(xì)胞形態(tài)與黑素合成1、下調(diào)mGluR4破壞小鼠B16細(xì)胞形態(tài)。2、下調(diào)mGluR4降低黑素合成相關(guān)基因MITF、TYR、TRP-1等的m RNA水平。3、下調(diào)mGluR4減少小鼠B16細(xì)胞黑素合成。4、下調(diào)mGluR4抑制小鼠B16細(xì)胞TYR活性。(三)姜黃素通過激活mGluR4而抑制Th17細(xì)胞分化1、姜黃素濃度25μM時,對細(xì)胞有明顯的毒性作用。2、25μM姜黃素抑制小鼠BMDC IL-6、IL-23 m RNA水平。3、25μM姜黃素抑制BMDC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力,并降低與BMDC共培養(yǎng)體系中IL-17A、RORγt的m RNA水平。4、下調(diào)mGluR4促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。5、25μM姜黃素增加小鼠BMDC表面mGluR4的表達(dá)。四、結(jié)論(一)BMDC表面mGluR4敲減可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化1、BMDC可作為DC表型與功能研究的較理想的體外模型。2、小鼠BMDC表面有mGluR4的表達(dá)。3、下調(diào)BMDC表面mGluR4的表達(dá),可促進(jìn)與BMDC共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。(二)BMDC表面mGluR4敲減誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化可影響小鼠B16細(xì)胞形態(tài)與黑素合成1、BMDC表面mGluR4的表達(dá)下調(diào)是誘導(dǎo)Th17分化的必要因素,而后者與B16細(xì)胞黑素合成的相關(guān)基因有關(guān)。2、BMDC表面mGluR4的表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)Th17分化等機(jī)制有可能是白癜風(fēng)發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制之一。3、BMDC表面mGluR4有可能成為調(diào)控白癜風(fēng)患者免疫學(xué)異常的治療靶位。(三)姜黃素可通過活化BMDC表面mGlu R4而抑制Th17細(xì)胞分化1、姜黃素可減弱BMDC刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力,并抑制Th17細(xì)胞分化。2、下調(diào)BMDC表面mGluR4的表達(dá),可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化。3、姜黃素能夠增加小鼠BMDC表面mGluR4的表達(dá),可能是其抑制Th17細(xì)胞分化的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R758.41

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1 趙光明;小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞通過mGluR4影響B(tài)16細(xì)胞黑素合成及姜黃素的作用機(jī)制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號：1291287