本文關(guān)鍵詞：不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦WNT6基因突變位點篩查及KIR2DL4基因多態(tài)性研究

  更多相關(guān)文章： WNT6 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 錯義突變 基因突變 KIR2DL4 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) SNP NK細胞

【摘要】：研究背景復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent Miscarriage, RM)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn),不管既往有無活產(chǎn)史。發(fā)病率在1%-3%,其發(fā)病機制非常復(fù)雜,除染色體、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫等已知的致病因素外,仍約一半原因不明。染色體異常一直被認為是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要發(fā)病因素之一,目前臨床能夠檢測出的夫婦雙方及胚胎組織染色體異常集中在染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常,而在分子水平上的染色體異常仍然處于科研研究階段,仍然屬于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)范疇。目前不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)分子遺傳學(xué)水平的研究主要集中在血栓形成細胞因子、膜聯(lián)蛋白基因多態(tài)性以及幾種基因聯(lián)合異常與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)論也多不一致。子宮內(nèi)膜的蛻膜化過程是近年不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究的新點。子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)是正常妊娠建立和維持的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,涉及基質(zhì)細胞大量增殖、分化及凋亡,受復(fù)雜的分子信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。已有研究表明子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中Wnt蛋白的參與起到重要的作用。Wnt (wingless-type MMTV integration site family)基因家族,在物種間高度保守,以往的研究集中在調(diào)控胚胎期各器官的生長發(fā)育,與HOX家族協(xié)同調(diào)控女性苗勒氏管的正常發(fā)育與融合。目前的研究顯示,Wnt家族通過Wnt- β-catenin信號通路,分泌Wnt蛋白,參與子宮內(nèi)膜蛻膜化改變,Wnt-β-catenin信號通路失活可限制囊胚的植入與生長。WNT6是Wnt家族一員,基因序列在物種之間具有高保守性,最新研究顯示,Wnt6在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中起到必不可少的作用。通過研究小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),從胚胎著床后的第6天開始,Wnt6mRNA水平明顯增加,原位雜交的結(jié)果顯示,隨著子宮內(nèi)膜蛻膜化的進展,Wnt6蛋白在移植的第1-4天表達量很少,從第5天起囊胚周圍的增生的子宮問質(zhì)細胞上表達越來越多。對Wnt6基因敲除小鼠與野生型小鼠研究中發(fā)現(xiàn),Wnt一’小鼠產(chǎn)出的幼仔的尺寸明顯小于野生型小鼠,并且對移植第7天后的移植部位的內(nèi)膜組織重量比較,明顯比野生型小鼠輕：研究同時通過體外培養(yǎng)缺失WNT6基因的子宮間質(zhì)細胞,發(fā)現(xiàn)細胞明顯生長緩慢,生長周期延長,因此提出Wnt6與妊娠早期的子宮內(nèi)膜蛻膜化進程相關(guān)。而關(guān)于WNT6基因與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的之間關(guān)系未見報道。因此本研究第一部分旨在中國漢族不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者夫婦中對WNT6基因進行突變位點篩查及功能預(yù)測。另一方面,母體的生殖免疫平衡調(diào)節(jié)也是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究重點和熱點。很多的研究表明免疫平衡失衡,導(dǎo)致母體對胎兒的“免疫耐受”消失,激活母胎界面NK細胞,導(dǎo)致妊娠流產(chǎn)的發(fā)生。KIR2DL4屬于免疫球蛋白樣受體家族,是目前NK細胞受體研究領(lǐng)域的熱點,它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具有激活性和抑制性受體的雙重結(jié)構(gòu)特點,并且研究也已經(jīng)證實它與妊娠早期胎盤表面表達的HLA-G配體結(jié)合,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。KIR2DL4廣泛表達于所有NK細胞,且孕早期的子宮脫膜組織表達豐富。在對KIR2DL4分子結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性與其功能活性密切相關(guān)。有研究者對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者KIR2DL4的跨膜區(qū)域內(nèi)含子6、外顯子7基因型頻率進行分析,其基因型頻率與對照組分布明顯不同,揭示了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者該基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性。還有研究表明外顯子7的10A(跨膜外顯子編碼區(qū)10個連續(xù)腺嘌呤結(jié)構(gòu))編碼受體的全長,而9A外顯子編碼導(dǎo)致終止密碼提前發(fā)生,同時在至少有一條10A的等位基因的受試者體內(nèi)的少量CD56Bright NK細胞表面檢測到KIR2DL4的表達,體外NK細胞培養(yǎng)研究證實,至少有一條10A的等位基因型能激活NK細胞,而9A純合等位基因型不能激活NK細胞。那么對于KIR2DL4的基因多態(tài)性尤其是跨膜區(qū)域的10A/9A多態(tài)位點,與中國漢族人群不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性分析,值得在本研究的第二部分進行探討分析。既往不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的分子遺傳學(xué)研究多集中篩查女性患者,忽略男性伴侶同時進行對照排除研究：另外,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病率低,因此病例收集困難,研究樣本普遍偏小。本研究從臨床樣本庫中嚴格篩選合格病例,擴大了病例數(shù)量,對病例組與對照組夫婦雙方共同進行大規(guī)模的基因突變位點篩查及基因多態(tài)性的分析,探討了WNT6基因和KIR2DL4基因與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。第一部分 WNT6基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦基因突變位點的篩查研究目的通過對中國漢族100對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦WNT6基因突變位點的篩查,探討不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是否與WNT6基因突變相關(guān)。研究方法利用PCR擴增及Sanger法基因測序技術(shù),對中國漢族100對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦和中國漢族100對正常生育夫婦行WNT6基因4個外顯子的基因序列及相關(guān)側(cè)翼序列檢測。與Ensembl提供的正常序列比對,分析WNT6基因編碼序列是否存在異常堿基改變、插入或缺失。若發(fā)現(xiàn)新的突變位點,則擴大對照組樣本量,進一步驗證突變位點是否只存在于病例組。后續(xù)應(yīng)用多個在線軟件預(yù)測突變位點對基因功能的影響。研究結(jié)果測序結(jié)果顯示病例組4名女性患者WNT6基因各自篩查出4個新發(fā)突變位點： 1個位于內(nèi)含子1與外顯子1交界序列,屬無義突變；2個位于外顯子3編碼序列,一個錯義突變,一個同義突變；1個位于3’UTR區(qū)域,突變意義不詳。病例組男性患者及對照組夫婦雙方均未發(fā)現(xiàn)相同突變位點。位于該基因外顯子3的錯義突變?yōu)閏.443T；G,該突變位于WNT1功能域,突變導(dǎo)致編碼氨基酸改變,且兩種氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均不同,進一步的蛋白質(zhì)模型預(yù)測表明其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到影響。擴大對照組女方樣本量1倍,仍未發(fā)現(xiàn)相同的新發(fā)錯義突變位點。所有樣本均未檢測到己知的SNPs位點。結(jié)論不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性患者WNT6基因錯義突變可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一,為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因?qū)W研究補充新內(nèi)容,在國際上未見相同報道,仍需要進一步的功能實驗驗證。第二部分KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究研究目的 本研究對96對中國漢族不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者夫婦進行KIR2DL4基因多態(tài)性分析,探討KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性。研究方法 以96對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦和94對正常生育夫婦為研究對象,對KIR2DL4基因外顯子3、外顯子5、外顯子7、外顯子8和外顯子9基因序列行PCR-SBT擴增測序,即采用兩對引物,外顯子3和5用一對引物,外顯子7、8和9用一對引物,擴增產(chǎn)物經(jīng)兩步純化后,用四對引物分別從上、下游測序,測序方法采用直接基因測序技術(shù)。分析基因在總?cè)巳褐械任换蝾l率的發(fā)生率,以及外顯子7的9A/10A多態(tài)位點等位基因頻率在病例組和對照組的差異。研究結(jié)果 測序結(jié)果分析顯示該研究中國漢族人群的基因型分布符合文獻報道的中國人群的基因型分布。而位于跨膜區(qū)域第7外顯子I0A/9A多態(tài)位點：基因型頻率比較發(fā)現(xiàn),本研究人群中總的基因型頻率的比較無統(tǒng)計學(xué)差異；夫婦一方或夫婦雙方的基因型頻率在兩組之間均無明顯差異。等位基因型頻率比較發(fā)現(xiàn),該多態(tài)位點等位基因型頻率在本研究人群中與中國漢族人群報道的等位基因型頻率比較無統(tǒng)計學(xué)差異；兩組中男方或夫婦雙方的等位基因基因型頻率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。女方9A等位基因型頻率(19.3%)高于對照組(14.9%),9A單倍體型在病例組有增高的趨勢,但經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,差異無顯著性。結(jié)論 KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生無相關(guān)性。KIR2DL4等位基因型9A在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性患者中有增高的趨勢,需要進一步擴大樣本研究證實。
【關(guān)鍵詞】：WNT6 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 錯義突變 基因突變 KIR2DL4 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) SNP NK細胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.21
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號說明17-19
• 第一部分 WNT6基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦基因突變位點的篩查19-41
• 前言19-21
• 材料與方法21-29
• 實驗結(jié)果29-30
• 討論30-33
• 結(jié)論33-34
• 附圖附表34-36
• 參考文獻36-41
• 第二部分 KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究41-65
• 前言41-43
• 材料與方法43-50
• 實驗結(jié)果50-53
• 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 附圖、附表57-59
• 參考文獻59-65
• 綜述65-83
• 參考文獻74-83
• 致謝83-84
• 攻讀博士學(xué)位期間撰寫和發(fā)表的論文84-85
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表85-86
• 外文論文一86-92
• 外文論文二92-105

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 顏衛(wèi)華;人類白細胞抗原與人類巨細胞病毒[J];免疫學(xué)雜志;2002年02期

2 顏衛(wèi)華;NK細胞受體KIR2DL4的結(jié)構(gòu)與功能[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

，

本文編號：1111488