本文關(guān)鍵詞：不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦WNT6基因突變位點(diǎn)篩查及KIR2DL4基因多態(tài)性研究

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【摘要】：研究背景復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent Miscarriage, RM)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn),不管既往有無活產(chǎn)史。發(fā)病率在1%-3%,其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,除染色體、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫等已知的致病因素外,仍約一半原因不明。染色體異常一直被認(rèn)為是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要發(fā)病因素之一,目前臨床能夠檢測(cè)出的夫婦雙方及胚胎組織染色體異常集中在染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常,而在分子水平上的染色體異常仍然處于科研研究階段,仍然屬于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)范疇。目前不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)分子遺傳學(xué)水平的研究主要集中在血栓形成細(xì)胞因子、膜聯(lián)蛋白基因多態(tài)性以及幾種基因聯(lián)合異常與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)論也多不一致。子宮內(nèi)膜的蛻膜化過程是近年不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)研究的新點(diǎn)。子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)是正常妊娠建立和維持的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,涉及基質(zhì)細(xì)胞大量增殖、分化及凋亡,受復(fù)雜的分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。已有研究表明子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中Wnt蛋白的參與起到重要的作用。Wnt (wingless-type MMTV integration site family)基因家族,在物種間高度保守,以往的研究集中在調(diào)控胚胎期各器官的生長(zhǎng)發(fā)育,與HOX家族協(xié)同調(diào)控女性苗勒氏管的正常發(fā)育與融合。目前的研究顯示,Wnt家族通過Wnt- β-catenin信號(hào)通路,分泌Wnt蛋白,參與子宮內(nèi)膜蛻膜化改變,Wnt-β-catenin信號(hào)通路失活可限制囊胚的植入與生長(zhǎng)。WNT6是Wnt家族一員,基因序列在物種之間具有高保守性,最新研究顯示,Wnt6在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中起到必不可少的作用。通過研究小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),從胚胎著床后的第6天開始,Wnt6mRNA水平明顯增加,原位雜交的結(jié)果顯示,隨著子宮內(nèi)膜蛻膜化的進(jìn)展,Wnt6蛋白在移植的第1-4天表達(dá)量很少,從第5天起囊胚周圍的增生的子宮問質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)越來越多。對(duì)Wnt6基因敲除小鼠與野生型小鼠研究中發(fā)現(xiàn),Wnt一’小鼠產(chǎn)出的幼仔的尺寸明顯小于野生型小鼠,并且對(duì)移植第7天后的移植部位的內(nèi)膜組織重量比較,明顯比野生型小鼠輕：研究同時(shí)通過體外培養(yǎng)缺失WNT6基因的子宮間質(zhì)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)周期延長(zhǎng),因此提出Wnt6與妊娠早期的子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程相關(guān)。而關(guān)于WNT6基因與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的之間關(guān)系未見報(bào)道。因此本研究第一部分旨在中國(guó)漢族不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者夫婦中對(duì)WNT6基因進(jìn)行突變位點(diǎn)篩查及功能預(yù)測(cè)。另一方面,母體的生殖免疫平衡調(diào)節(jié)也是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。很多的研究表明免疫平衡失衡,導(dǎo)致母體對(duì)胎兒的“免疫耐受”消失,激活母胎界面NK細(xì)胞,導(dǎo)致妊娠流產(chǎn)的發(fā)生。KIR2DL4屬于免疫球蛋白樣受體家族,是目前NK細(xì)胞受體研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具有激活性和抑制性受體的雙重結(jié)構(gòu)特點(diǎn),并且研究也已經(jīng)證實(shí)它與妊娠早期胎盤表面表達(dá)的HLA-G配體結(jié)合,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。KIR2DL4廣泛表達(dá)于所有NK細(xì)胞,且孕早期的子宮脫膜組織表達(dá)豐富。在對(duì)KIR2DL4分子結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性與其功能活性密切相關(guān)。有研究者對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者KIR2DL4的跨膜區(qū)域內(nèi)含子6、外顯子7基因型頻率進(jìn)行分析,其基因型頻率與對(duì)照組分布明顯不同,揭示了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者該基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性。還有研究表明外顯子7的10A(跨膜外顯子編碼區(qū)10個(gè)連續(xù)腺嘌呤結(jié)構(gòu))編碼受體的全長(zhǎng),而9A外顯子編碼導(dǎo)致終止密碼提前發(fā)生,同時(shí)在至少有一條10A的等位基因的受試者體內(nèi)的少量CD56Bright NK細(xì)胞表面檢測(cè)到KIR2DL4的表達(dá),體外NK細(xì)胞培養(yǎng)研究證實(shí),至少有一條10A的等位基因型能激活NK細(xì)胞,而9A純合等位基因型不能激活NK細(xì)胞。那么對(duì)于KIR2DL4的基因多態(tài)性尤其是跨膜區(qū)域的10A/9A多態(tài)位點(diǎn),與中國(guó)漢族人群不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性分析,值得在本研究的第二部分進(jìn)行探討分析。既往不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的分子遺傳學(xué)研究多集中篩查女性患者,忽略男性伴侶同時(shí)進(jìn)行對(duì)照排除研究：另外,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病率低,因此病例收集困難,研究樣本普遍偏小。本研究從臨床樣本庫中嚴(yán)格篩選合格病例,擴(kuò)大了病例數(shù)量,對(duì)病例組與對(duì)照組夫婦雙方共同進(jìn)行大規(guī)模的基因突變位點(diǎn)篩查及基因多態(tài)性的分析,探討了WNT6基因和KIR2DL4基因與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。第一部分 WNT6基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦基因突變位點(diǎn)的篩查研究目的通過對(duì)中國(guó)漢族100對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦WNT6基因突變位點(diǎn)的篩查,探討不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是否與WNT6基因突變相關(guān)。研究方法利用PCR擴(kuò)增及Sanger法基因測(cè)序技術(shù),對(duì)中國(guó)漢族100對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦和中國(guó)漢族100對(duì)正常生育夫婦行WNT6基因4個(gè)外顯子的基因序列及相關(guān)側(cè)翼序列檢測(cè)。與Ensembl提供的正常序列比對(duì),分析WNT6基因編碼序列是否存在異常堿基改變、插入或缺失。若發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn),則擴(kuò)大對(duì)照組樣本量,進(jìn)一步驗(yàn)證突變位點(diǎn)是否只存在于病例組。后續(xù)應(yīng)用多個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)對(duì)基因功能的影響。研究結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示病例組4名女性患者WNT6基因各自篩查出4個(gè)新發(fā)突變位點(diǎn)： 1個(gè)位于內(nèi)含子1與外顯子1交界序列,屬無義突變；2個(gè)位于外顯子3編碼序列,一個(gè)錯(cuò)義突變,一個(gè)同義突變；1個(gè)位于3’UTR區(qū)域,突變意義不詳。病例組男性患者及對(duì)照組夫婦雙方均未發(fā)現(xiàn)相同突變位點(diǎn)。位于該基因外顯子3的錯(cuò)義突變?yōu)閏.443T；G,該突變位于WNT1功能域,突變導(dǎo)致編碼氨基酸改變,且兩種氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均不同,進(jìn)一步的蛋白質(zhì)模型預(yù)測(cè)表明其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到影響。擴(kuò)大對(duì)照組女方樣本量1倍,仍未發(fā)現(xiàn)相同的新發(fā)錯(cuò)義突變位點(diǎn)。所有樣本均未檢測(cè)到己知的SNPs位點(diǎn)。結(jié)論不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性患者WNT6基因錯(cuò)義突變可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一,為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因?qū)W研究補(bǔ)充新內(nèi)容,在國(guó)際上未見相同報(bào)道,仍需要進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第二部分KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究研究目的 本研究對(duì)96對(duì)中國(guó)漢族不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者夫婦進(jìn)行KIR2DL4基因多態(tài)性分析,探討KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性。研究方法 以96對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦和94對(duì)正常生育夫婦為研究對(duì)象,對(duì)KIR2DL4基因外顯子3、外顯子5、外顯子7、外顯子8和外顯子9基因序列行PCR-SBT擴(kuò)增測(cè)序,即采用兩對(duì)引物,外顯子3和5用一對(duì)引物,外顯子7、8和9用一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)兩步純化后,用四對(duì)引物分別從上、下游測(cè)序,測(cè)序方法采用直接基因測(cè)序技術(shù)。分析基因在總?cè)巳褐械任换蝾l率的發(fā)生率,以及外顯子7的9A/10A多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率在病例組和對(duì)照組的差異。研究結(jié)果 測(cè)序結(jié)果分析顯示該研究中國(guó)漢族人群的基因型分布符合文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)人群的基因型分布。而位于跨膜區(qū)域第7外顯子I0A/9A多態(tài)位點(diǎn)：基因型頻率比較發(fā)現(xiàn),本研究人群中總的基因型頻率的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；夫婦一方或夫婦雙方的基因型頻率在兩組之間均無明顯差異。等位基因型頻率比較發(fā)現(xiàn),該多態(tài)位點(diǎn)等位基因型頻率在本研究人群中與中國(guó)漢族人群報(bào)道的等位基因型頻率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組中男方或夫婦雙方的等位基因基因型頻率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。女方9A等位基因型頻率(19.3%)高于對(duì)照組(14.9%),9A單倍體型在病例組有增高的趨勢(shì),但經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異無顯著性。結(jié)論 KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生無相關(guān)性。KIR2DL4等位基因型9A在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性患者中有增高的趨勢(shì),需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：WNT6 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 錯(cuò)義突變 基因突變 KIR2DL4 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) SNP NK細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.21
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號(hào)說明17-19
• 第一部分 WNT6基因在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦基因突變位點(diǎn)的篩查19-41
• 前言19-21
• 材料與方法21-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 討論30-33
• 結(jié)論33-34
• 附圖附表34-36
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 第二部分 KIR2DL4基因多態(tài)性與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究41-65
• 前言41-43
• 材料與方法43-50
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-53
• 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 附圖、附表57-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 綜述65-83
• 參考文獻(xiàn)74-83
• 致謝83-84
• 攻讀博士學(xué)位期間撰寫和發(fā)表的論文84-85
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表85-86
• 外文論文一86-92
• 外文論文二92-105

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 顏衛(wèi)華;人類白細(xì)胞抗原與人類巨細(xì)胞病毒[J];免疫學(xué)雜志;2002年02期

2 顏衛(wèi)華;NK細(xì)胞受體KIR2DL4的結(jié)構(gòu)與功能[J];免疫學(xué)雜志;2003年S1期

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本文編號(hào)：1111488