本文關鍵詞：嵌合TCR分子在T細胞中表達、組裝和功能的研究

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【摘要】：研究背景和目的T細胞受體(TCR)是T細胞表面能夠識別和結合蛋白質(zhì)抗原的特異性受體。當機體受到腫瘤抗原刺激時,由TCR對APC呈遞的靶細胞表面抗原肽-MHC復合物識別抗原。TCR在細胞免疫中發(fā)揮著重要的靶向性作用,TCR基因修飾的T細胞過繼性轉移可以誘導某些特定的T細胞瞬時增殖,并允許引入T細胞池中沒有的特異性TCR,增強免疫系統(tǒng)介導的對腫瘤細胞的消除,因此在轉TCR基因免疫治療中,將識別腫瘤抗原的特異性TCR基因導入患者T細胞,可使患者的無能T細胞重新獲得具有腫瘤抗原識別和應答的能力。利用抗原特異性TCR基因修飾T細胞進行過繼性移植/回輸,是近年來獲得較高關注的一種特異性的癌癥新療法。Rosenberg領導的研究團隊于2006年完成了應用TCR基因治療黑色素腫瘤患者的人體臨床試驗。在Ⅰ期臨床試驗中,利用逆轉錄病毒將特異性識別黑色素瘤相關MART-1抗原的TCR基因修飾T淋巴細胞,擴增出大約109-1010 MART-1特異性T細胞,然后轉導入HLA-A2限制性轉移性黑色素瘤患者。實驗結果觀察到17名患者中的2名腫瘤細胞持續(xù)性減少,而且在治療完成一年后仍可檢測到基因修飾的TCR表達。這項試驗第一次證明了TCR基因治療在臨床應用的可行性,也為轉TCR基因免疫治療提供了實踐依據(jù)。雖然上述研究證明了TCR基因治療的可行性和潛在應用前景,但是仍面臨很多問題,關鍵問題之一是外源性的TCRα和β鏈與內(nèi)源性的α和β鏈之間會相互識別配對形成雜合TCR。我們實驗室前期從肝癌患者的腫瘤組織中成功篩選分離出一種特異性TCR (Val2和Vβ7),經(jīng)研究表明,在轉導的T細胞中TCRα12和β7的表達低于內(nèi)源性TCRap的水平,并且外源導入的TCRa12和β7鏈與內(nèi)源性TCR產(chǎn)生了錯配TCRo TCR錯配這種現(xiàn)象被認為廣泛存在于TCR基因治療中,并導致引入的有治療意義的TC(?) kαβ分子在表面表達被稀釋,細胞表面的轉TCR表達量下降、細胞活性降低。此外錯配TCR還可能形成一種能產(chǎn)生未知特異性的新的TCR,這種新的TCR會在轉TCR基因治療中帶來自身免疫性(on-target)或交叉反應(off-target)毒性。雖然目前TCR錯配引起的自身反應疾病還沒有臨床證據(jù),但是由雜合TCR所帶來的自身免疫風險卻不容忽視。實際上,表達錯配TCR分子的T細胞在高濃度IL-2條件下擴增已經(jīng)在臨床前模型中被證實會引起移植物抗宿主病(GvHD)。因此轉TCR在T細胞的表達和配對組裝以及與pMHC的親和力都是TCR基因治療充分發(fā)揮抗腫瘤能力的關鍵。因此如何改造修飾轉TCR基因使得轉TCRα鏈和β鏈能在T細胞表面正確配對,并且其表達效率和親和力都增強,同時避免產(chǎn)生具有on-target或off-target毒性的未知TCR成為近年來TCR基因治療的一個熱點之一。比如有研究者采用以下方法來減少轉TCR的錯配：在TCR鏈中引入二硫鍵；采用鼠源性保守C區(qū)替換人TCR分子的C區(qū)；將TCRa和β鏈接口處保守結構域的氨基酸殘基翻轉；單鏈TCR (scTCR)嵌合體；將TCR鏈的C區(qū)與CD3分子融合；將aβTCR基因轉入γδT細胞中等。綜上所述,目前雖然提出了策略對轉TCR基因進行修飾以優(yōu)化外源TCR分子的配對,但仍然有很多需要改進的地方,比如在TCR分子的C區(qū)引入二硫鍵的改造策略使得TCR轉T細胞的新反應性減少,但是錯配TCR依然存在。鼠源化C區(qū)替換人C去的改造方法由于鼠源片斷的免疫原性,很可能誘導宿主產(chǎn)生HAMA (Human anti-mouse antibody),因此這一方法很難應用在臨床治療上。翻轉TCRα和β鏈接口處保守結構域的氨基酸殘基的改造方法雖然在一定程度上解決了TCR錯配問題,但是外源TCR優(yōu)先配對的能力有限,并且pMHC結合能力和T細胞重定向功能都不理想。對于單鏈TCR構象能否保持穩(wěn)定、同CD3分子的結合是否有效等仍有待研究。因此還需要尋找其他一些方法對TCR分子進行改造,在降低錯配產(chǎn)生的條件下還能夠保持抗原識別特異性。本研究將針對我們實驗室從肝癌患者中成功分離出的一種特異性TCR(Val2和Vβ7)分子進行改造,在綜合國內(nèi)外相關領域的最新研究進展的基礎上,我們設計了4種修飾的TCR分子,命名為Chimeric TCR (chimTCR)。改造方案一,根據(jù)之前研究認為αβTCR不會與γδTCR形成錯配,且αβTCR與γδTCR同屬TCR家族,同源性較高。因此,我們據(jù)此設計了3種嵌合γδTC R結構域的嵌合型αβTCR,第一種嵌合TCR (chimeric1 TCR)將αβTCR的C區(qū)替換為γ8TCR的C區(qū)但是保留αβTCR的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),形成三明治結構：第二種嵌合TCR (chimeric2 TCR)將apTCR的C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)替換為γδTCR C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)；第三種嵌合TCR (chimeric3 TCR)將αβTCR的整個C區(qū)結構域都替換為γδTCR的整個C區(qū)。改造方案二,由于TCR的胞內(nèi)區(qū)很短,沒有轉導信號的序列,需要與胞內(nèi)CD3分子的信號亞基結合來轉導抗原刺激信號,因此,第四種嵌合TCR我們將αβTCR C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)替換為CD3ζ全長。我們對這4種嵌合TCR展開研究,一方面研究這些嵌合TCR分子是否能夠避免與內(nèi)源TCR錯配；另一方面由于目前對于TCR分子各個結構域的功能尚不是很清楚,我們也期望通過對結構域替換的嵌合TCR的研究初步探討aβTCR或γδTCR結構域的功能。整個研究分為4部分進行。首先采用分子克隆從健康人外周血中釣取y982TCR和CD3ζ全長,然后運用生物信息學方法對α12β7TCR、y982TCR和CD3ζ的一級結構序列特點進行分析,并進行二級結構預測,初步確定結構域替換位點之后對嵌合TCR分子的三級結構進行預測并優(yōu)化融合位點；然后針對生物信息學預測的結構域替換位點設計了4套重疊PCR引物,克隆并鑒定了攜帶熒光蛋白的嵌合TCR雙表達載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP以及不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,包裝腺病毒；接著將這些嵌合TCR分子轉染受體細胞,分析嵌合TCRa和p鏈在細胞表面的表達以及配對組裝能力；最后通過FRET方法分析了chimTCR 與 CD3ζ的相互作用,另外研究了嵌合TCR轉T細胞的CTL效應及細胞因子分泌的能力,通過共定位分析了chim4TCR在T細胞中信號初始狀態(tài)。綜上,本課題希望對結構域替換后的嵌合TCR分子的配對組裝情況、結合CD3分子的能力、以及識別抗原和傳遞活化信號的能力的研究,為TCR基因修飾T細胞的過繼性治療研究及其臨床應用研究奠定基礎。一、yδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學分析該部分研究目的是確定apTCR, γδTCR, CD3ζ結構域替換位點,設計出結構穩(wěn)定合理的嵌合TCR分子。在正常人外周血中除了αβT細胞外(約占CD3+T細胞的95%),還有一種γδT細胞(約占CD3+T細胞的5%)。由于健康人外周血中γδTT細胞Vγ9鏈總是和Vδ2鏈一起表達(大多數(shù)健康人的Vγ9Vδ2 T細胞占外周血γδT細胞的50%～95%)。因此我們首先由健康人PBMC分離獲得γδTCR基因類型TCRVy9和TCRVδ2的基因序列,并與實驗室之前分離的αβTCR基因亞型在IMGT數(shù)據(jù)庫進行了一級序列比對分析。由健康人PBMC分離的CD3ζ采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對其一級結構進行分析。應用Jpred 和 PredietionProtein服務器預測TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的二級結構。應用TMHMM等5種跨膜程序預測TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜螺旋結構。應用Swiss-Model在線服務同源模建法進行TCRα12、β7、γ9和δ2三維結構的預測。最后應用Swiss-Model搜索出的比分最高的模板,采用軟件Modeller9V7對嵌合TCR分子進行三維結構模擬,并與原αβTCR分子之間的蛋白骨架以及抗原識別活性部位進行了空間結構比對和空間位置分析。結果IMGT數(shù)據(jù)庫比對分析確定了我們篩選分離獲得的TCRα12、β7、γ9和δ2鏈V-D-J或V-J連接區(qū)基因共同編碼的CDR3高變區(qū)。二級結構預測顯示在V結構域的CDR3高變區(qū)后都存在一個折疊區(qū)域,之后以一段loop形式與TCR的C區(qū)結構域相連接。綜合比較幾種跨膜軟件預測結果,確定了TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜區(qū)域。三維結構預測結果發(fā)現(xiàn)TCRα12與TCRδ2結構的同源性較高,TCRβ7和TCRγ9結構的同源性較高,并與預測的二級結構進行比較最終確定了結構域替換的位點。對嵌合TCR分子的三維建模結果顯示,嵌合TCR分子能維持原αβTCR蛋白V區(qū)結構的穩(wěn)定。因此,該部分通過生物信息學分析確定了結構域替換位點成功設計了4種嵌合TCR分子,且這些嵌合TCR分子的結構域具有良好的穩(wěn)定性。二、嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝本部分的研究目的是構建一組可用于FRET檢測的含熒光蛋白的嵌合TCR分子雙表達載體,以及一組不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出具有感染能力的腺病毒。我們針對第一章確定的結構域融合位點采用primer premier5.0和Oligo6.0成功設計了4套重疊PCR引物。通過重疊PCR一步法獲得chimTRA-CFP和chimTRB-YFP融合基因。chimTRA-CFP經(jīng)BstX Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切插入質(zhì)粒pIRES2-EGFP的IRES下游替換EGFP蛋白獲得重組質(zhì)粒pIRES2-chimTRA/CFP； chimTRB-YFP經(jīng)Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切插入上述重組質(zhì)粒pIRES2-chimTRA/CFP中IRES上游的多克隆位點,得到重組雙表達載體pIRES2-chimTRB/YFP-chimTRA/CFP,并進行測序鑒定。以同樣的方法構建不含熒光蛋白的腺病毒雙表達載體pIRES2-chimTRB-chimTRA,然后將chimTRB-IRES-chimTRA表達盒插入質(zhì)粒pDC315中,獲得嵌合TCR的重組腺病毒穿梭載體pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA, 并進行測序鑒定。將pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA與Ad5/F35重組嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒 pBHGIoxdeE 1 Cre共轉染HEK-293細胞進行嵌合TCR重組腺病毒的包裝,并采用TCID50方法進行滴度測定,通過PCR對各重組腺病毒基因組進行檢測,轉染Jukat細胞后流式鑒定嵌合TCR的表達及摸索最佳感染復數(shù)和感染時間。統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示。應用SPSS(?) v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進行統(tǒng)計分析。各指標先進行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設計,分析兩種干預交互作用、單獨效應及主效應,采用t檢驗與單因素方差分析進行單因素分析,多重比較使用LSD法。當P0.05時,被認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果成功設計了4套重疊PCR引物,并通過重疊PCR一步法成功獲得chimTCRa 和 chimTCRβ的融合基因；成功構建了4種含熒光蛋白的真核雙表達載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP;成功構建了4種不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,并包裝出了具有感染能力的重組腺病毒,通過PCR驗證chimTCRs整合至病毒基因組中；4種重組嵌合腺病毒的滴度都在109IU/ml以上,并可有效轉染Jukat細胞,以MOI=100 (PFU)感染時間為48h時,嵌合TCR的表達效率最高。因此,本部分成功構建了含熒光蛋白的4種嵌合TCR分子的雙表達載體,另外成功構建了不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出了具有感染能力的重組嵌合腺病毒。三、嵌合TCR分子的表達和配對組裝分析本部分的目的是研究嵌合TCR分子在受體細胞的表達水平、自身的配對能力以及與內(nèi)源TCR分子的錯配程度。將這4種攜帶熒光蛋白的重組表達質(zhì)粒pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP轉染BEL-7402和Jurkat細胞,并通過激光掃描共聚焦顯微鏡掃描轉染細胞,其中458nm激發(fā)波長激發(fā)供體chimTRACFP.515 nm激發(fā)波長激發(fā)受體chimTRBYFP,然后掃描細胞獲得熒光圖像,其中掃描ECFP通道獲得青色熒光圖象,EYFP通道獲得黃色熒光圖象。然后利用致敏受體發(fā)射方法(sensitized acceptor emission method, SE)進行分析獲得pFRET和FRET效率熒光圖片,接著每個樣本選擇4組細胞的FRET效率熒光圖片,并在每組細胞FRET效率熒光圖片上隨機選取5個興趣點(ROI)的熒光值進行進一步的統(tǒng)計學分析,比較各嵌合TCR分子的相互作用,確定其與內(nèi)源TCR的錯配情況。將4種不攜帶熒光蛋白的嵌合TCR重組腺病毒轉染Jurkat細胞,72h后收獲細胞,并以TCRVp7-PE、TCR Va12-FITC抗體染色,流式細胞術檢測各嵌合TCR分子Vβ7和Vα12的表達。統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示。應用SPSS(?) v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進行統(tǒng)計分析。各指標先進行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設計,分析兩種干預交互作用、單獨效應及主效應,采用t檢驗與單因素方差分析進行單因素分析,多重比較使用LSD法。當P0.05時,被認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果顯示4種攜帶熒光蛋白的嵌合TCR分子能定位于細胞膜表面并正常表達,特別是chim4TCR在沒有CD3分子存在的情況下也能非常強烈的表達于細胞表面,這意味著chim4TCR在細胞中的表達可以不依賴于CD3分子。SE-FRET以及統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),chim1TCR 和 chim2TCR在兩種細胞的FRET效率都高于wtTCR,但是依然與內(nèi)源TCR產(chǎn)生了少量的雜合TCR分子。雖然chim1TCR和chim2TC R在Jurkat細胞中不能避免錯配,但相比于、vtTC R在一定程度上減少了錯配。chim3TCR和chim4TCR在BEL-7402細胞和Jurkat細胞的FRET效率無統(tǒng)計學差異,這提示chim3TCR和chim4TCR能避免錯配。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)chimlTCR、chim2TCR 和 chim4TCR在Jurkat細胞表面的表達水平高于wtTCR,而chim3TCR在Jurkat細胞表面的表達效率最低,特別是chim4TCR相比于未經(jīng)改造的wtTCR及其他3種嵌合TCR其表面表達水平大大提高。因此,該部分研究表明chim4TCR不僅能夠避免與內(nèi)源TCR的錯配,且其在T細胞系以及非T細胞系表面表達水平都遠遠高于另3種chimTCR分子和wtTCR分子。chim3TCR雖然能避免錯配但是表達水平卻相比于wtTCR有所下降。chim1TCR 和 chim2TCR其表達相比于wtTCR稍有提高但是不能避免錯配。四、嵌合TCR基因轉染T細胞功能的研究該部分的目的是研究各chimTCR分子與CD3ζ的相互作用及信號傳遞能力,分析各chimTCR分子轉染T細胞后對腫瘤細胞的CTL效應及細胞因子分泌情況以探討其抗原識別能力,最后檢測了chim4TCR在細胞內(nèi)的信號初始狀態(tài)。通過第一章生物信息學分析的各TCR與CD3ζ的跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域,設計了能采用FRET方法分析TCR與CD3ζ相互作用的一對攜帶熒光蛋白的質(zhì)粒。構建了作為供體的4種pIRES-chimTRB-chimTRACFP質(zhì)粒和作為受體的pIRES-CD3ζTMYFP 和 pIRES-CD3ζFP重組質(zhì)粒。將以上質(zhì)粒分別共轉染BEL-7402細胞,激光共聚焦掃描顯微鏡掃描CFP和YFP在BEL-7402細胞內(nèi)的表達,SE-FRET分析嵌合TCR與CD3ζ的相互作用。分離健康人PBMC,并篩選出HLA-A2+陽性樣本,將、vtTCR及4種chimTCR的重組腺病毒轉染PBMC并設未轉染TCR對照組,72h后與HLA-A2-的靶細胞HepG-2, Huh-1以及HLA-A2"的靶細胞BEL-7402以效靶比30：1～1：1共孵育,作用4h后采用鈣黃綠素(Calcein-acetoxymethyl, CAM)釋放法檢測各組TCR轉PBMC對腫瘤細胞的殺傷效應；24h后ELISA檢測各組TCR轉PBMC的IFN-γ分泌水平。最后分別轉染重組質(zhì)粒chim4TCRYFP或CD3ζYFP至BEL-7402和Jurkat細胞,采用DiD對細胞膜進行染色,激光共聚焦掃描顯微鏡以515 nm激發(fā)波長和635nm激發(fā)波長分別激發(fā)YFP和DiD,發(fā)射波長由500nm-700nm掃描細胞獲得熒光圖像,之后通過細胞膜共定位分析chim4TCR在細胞內(nèi)信號初始狀態(tài)。統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示。應用SPSS() v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進行統(tǒng)計分析。各指標先進行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)比較采用析因設計,分析兩種干預交互作用、單獨效應及主效應。采用單因素方差分析和t檢驗完成單因素數(shù)據(jù)分析,多重比較使用LSD法。當P0.05時,被認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果顯示wtTCR和前3種嵌合γδTCR的chimTCR分子與CD3ζTM的FRET效率較低,提示這些TCR與CD3ζ在BEL-7402細胞中的相互作用較弱。而chim4TCR與CD3ζ能明顯檢測到FRET,提示chim4TCR中融合的CD3ζ依然能與CD3ζ有一定的相互作用,但是其程度低于chim4TCRαζ和 chim4TCRPβζ之間的相互作用。另外細胞毒實驗結果表明chim4TCR、chim1TCR 和 wtTCR轉染PBMC細胞能有效殺傷HLA-A2+的靶細胞,其中chim4TCR對靶細胞的裂解能力高于chim1TCR和wtTCR。但是chim2TCR和chim3TCR轉PBMC與未轉TCR的PBMC對HLA-A2+的靶細胞的殺傷效應沒有統(tǒng)計學差異,提示chim2TCR和chim3TCR可能在識別特異性抗原或信號傳遞方面能力受損。各組chimTCRs以及、vtTC R轉染T細胞對HLA-A2-的靶細胞沒有表現(xiàn)出殺傷效應。此外作用于HLA-A2+的靶細胞后,chim4TCR、wtTCR和chim1TCR基因轉染PBMC能分泌的IFN-γ,其中chim4TCR基因轉染組分泌的IFN-γ高于wtTCR 和 chim1TCR基因轉染組,而chim2TCR和chim3TCR與未經(jīng)轉染TCR的對照組相比無統(tǒng)計學差異。作用于HLA-A2-的靶細胞BEL-7402后,IFN-γ分泌水平均沒有顯著性差異。最后通過細胞膜共定位分析發(fā)現(xiàn)Chim4TCR或CD3ζ都共定位于膜上,確定了Chim4TCR在T細胞內(nèi)信號屬于未活化的初始狀態(tài)。因此,該部分研究證實Chim4TCR依然能與CD3ζ有一定的相互作用；Chim4TCR、chim1TCR依然保持原wtTCR的HLA-A2限制性,并具有良好的抗原特異性及信號傳遞能力,chim2TCR 和 chim3TCR可能失去了抗原識別能力或是信號傳遞能力受損而不足以促進細胞因子的分泌；另外chim4TCR在T細胞中的信號狀態(tài)是可控的。
【關鍵詞】：TCR基因治療 錯配 嵌合TCR γδTCR CD3ζ
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R450
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-41
• 參考文獻35-41
• 第一章 γδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學分析41-60
• 引言41-42
• 1.1 實驗材料42-44
• 1.2 實驗方法44-46
• 1.3 結果46-57
• 1.4 討論57-58
• 小結58-59
• 參考文獻59-60
• 第二章 嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝60-95
• 引言60-61
• 2.1 材料與設備61-63
• 2.2 實驗方法63-80
• 2.3 結果80-91
• 2.4 討論91-92
• 小結92-93
• 參考文獻93-95
• 第三章 嵌合TCR分子的表達和配對組裝分析95-113
• 引言95-96
• 3.1 材料與設備96-97
• 3.2 實驗方法97-103
• 3.3 結果103-108
• 3.4 討論108-110
• 小結110-111
• 參考文獻111-113
• 第四章 嵌合TCR基因轉染T細胞功能的研究113-154
• 引言113-115
• 4.1 材料與設備115-116
• 4.2 實驗方法116-124
• 4.3 實驗結果124-145
• 4.4 討論145-149
• 小結149-151
• 參考文獻151-154
• 研究展望154-155
• 附錄155-158
• 攻讀博士學位期間成果158-159
• 致謝159-161
• 統(tǒng)計學審稿證明161

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本文編號：1107254