本文關(guān)鍵詞：嵌合TCR分子在T細(xì)胞中表達(dá)、組裝和功能的研究

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【摘要】：研究背景和目的T細(xì)胞受體(TCR)是T細(xì)胞表面能夠識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)抗原的特異性受體。當(dāng)機(jī)體受到腫瘤抗原刺激時(shí),由TCR對(duì)APC呈遞的靶細(xì)胞表面抗原肽-MHC復(fù)合物識(shí)別抗原。TCR在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要的靶向性作用,TCR基因修飾的T細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移可以誘導(dǎo)某些特定的T細(xì)胞瞬時(shí)增殖,并允許引入T細(xì)胞池中沒有的特異性TCR,增強(qiáng)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的消除,因此在轉(zhuǎn)TCR基因免疫治療中,將識(shí)別腫瘤抗原的特異性TCR基因?qū)牖颊逿細(xì)胞,可使患者的無能T細(xì)胞重新獲得具有腫瘤抗原識(shí)別和應(yīng)答的能力。利用抗原特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過繼性移植/回輸,是近年來獲得較高關(guān)注的一種特異性的癌癥新療法。Rosenberg領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)于2006年完成了應(yīng)用TCR基因治療黑色素腫瘤患者的人體臨床試驗(yàn)。在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將特異性識(shí)別黑色素瘤相關(guān)MART-1抗原的TCR基因修飾T淋巴細(xì)胞,擴(kuò)增出大約109-1010 MART-1特異性T細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)導(dǎo)入HLA-A2限制性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到17名患者中的2名腫瘤細(xì)胞持續(xù)性減少,而且在治療完成一年后仍可檢測(cè)到基因修飾的TCR表達(dá)。這項(xiàng)試驗(yàn)第一次證明了TCR基因治療在臨床應(yīng)用的可行性,也為轉(zhuǎn)TCR基因免疫治療提供了實(shí)踐依據(jù)。雖然上述研究證明了TCR基因治療的可行性和潛在應(yīng)用前景,但是仍面臨很多問題,關(guān)鍵問題之一是外源性的TCRα和β鏈與內(nèi)源性的α和β鏈之間會(huì)相互識(shí)別配對(duì)形成雜合TCR。我們實(shí)驗(yàn)室前期從肝癌患者的腫瘤組織中成功篩選分離出一種特異性TCR (Val2和Vβ7),經(jīng)研究表明,在轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞中TCRα12和β7的表達(dá)低于內(nèi)源性TCRap的水平,并且外源導(dǎo)入的TCRa12和β7鏈與內(nèi)源性TCR產(chǎn)生了錯(cuò)配TCRo TCR錯(cuò)配這種現(xiàn)象被認(rèn)為廣泛存在于TCR基因治療中,并導(dǎo)致引入的有治療意義的TC(?) kαβ分子在表面表達(dá)被稀釋,細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)TCR表達(dá)量下降、細(xì)胞活性降低。此外錯(cuò)配TCR還可能形成一種能產(chǎn)生未知特異性的新的TCR,這種新的TCR會(huì)在轉(zhuǎn)TCR基因治療中帶來自身免疫性(on-target)或交叉反應(yīng)(off-target)毒性。雖然目前TCR錯(cuò)配引起的自身反應(yīng)疾病還沒有臨床證據(jù),但是由雜合TCR所帶來的自身免疫風(fēng)險(xiǎn)卻不容忽視。實(shí)際上,表達(dá)錯(cuò)配TCR分子的T細(xì)胞在高濃度IL-2條件下擴(kuò)增已經(jīng)在臨床前模型中被證實(shí)會(huì)引起移植物抗宿主病(GvHD)。因此轉(zhuǎn)TCR在T細(xì)胞的表達(dá)和配對(duì)組裝以及與pMHC的親和力都是TCR基因治療充分發(fā)揮抗腫瘤能力的關(guān)鍵。因此如何改造修飾轉(zhuǎn)TCR基因使得轉(zhuǎn)TCRα鏈和β鏈能在T細(xì)胞表面正確配對(duì),并且其表達(dá)效率和親和力都增強(qiáng),同時(shí)避免產(chǎn)生具有on-target或off-target毒性的未知TCR成為近年來TCR基因治療的一個(gè)熱點(diǎn)之一。比如有研究者采用以下方法來減少轉(zhuǎn)TCR的錯(cuò)配：在TCR鏈中引入二硫鍵；采用鼠源性保守C區(qū)替換人TCR分子的C區(qū)；將TCRa和β鏈接口處保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基翻轉(zhuǎn)；單鏈TCR (scTCR)嵌合體；將TCR鏈的C區(qū)與CD3分子融合；將aβTCR基因轉(zhuǎn)入γδT細(xì)胞中等。綜上所述,目前雖然提出了策略對(duì)轉(zhuǎn)TCR基因進(jìn)行修飾以優(yōu)化外源TCR分子的配對(duì),但仍然有很多需要改進(jìn)的地方,比如在TCR分子的C區(qū)引入二硫鍵的改造策略使得TCR轉(zhuǎn)T細(xì)胞的新反應(yīng)性減少,但是錯(cuò)配TCR依然存在。鼠源化C區(qū)替換人C去的改造方法由于鼠源片斷的免疫原性,很可能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生HAMA (Human anti-mouse antibody),因此這一方法很難應(yīng)用在臨床治療上。翻轉(zhuǎn)TCRα和β鏈接口處保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的改造方法雖然在一定程度上解決了TCR錯(cuò)配問題,但是外源TCR優(yōu)先配對(duì)的能力有限,并且pMHC結(jié)合能力和T細(xì)胞重定向功能都不理想。對(duì)于單鏈TCR構(gòu)象能否保持穩(wěn)定、同CD3分子的結(jié)合是否有效等仍有待研究。因此還需要尋找其他一些方法對(duì)TCR分子進(jìn)行改造,在降低錯(cuò)配產(chǎn)生的條件下還能夠保持抗原識(shí)別特異性。本研究將針對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室從肝癌患者中成功分離出的一種特異性TCR(Val2和Vβ7)分子進(jìn)行改造,在綜合國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了4種修飾的TCR分子,命名為Chimeric TCR (chimTCR)。改造方案一,根據(jù)之前研究認(rèn)為αβTCR不會(huì)與γδTCR形成錯(cuò)配,且αβTCR與γδTCR同屬TCR家族,同源性較高。因此,我們據(jù)此設(shè)計(jì)了3種嵌合γδTC R結(jié)構(gòu)域的嵌合型αβTCR,第一種嵌合TCR (chimeric1 TCR)將αβTCR的C區(qū)替換為γ8TCR的C區(qū)但是保留αβTCR的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),形成三明治結(jié)構(gòu)：第二種嵌合TCR (chimeric2 TCR)將apTCR的C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)替換為γδTCR C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)；第三種嵌合TCR (chimeric3 TCR)將αβTCR的整個(gè)C區(qū)結(jié)構(gòu)域都替換為γδTCR的整個(gè)C區(qū)。改造方案二,由于TCR的胞內(nèi)區(qū)很短,沒有轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的序列,需要與胞內(nèi)CD3分子的信號(hào)亞基結(jié)合來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原刺激信號(hào),因此,第四種嵌合TCR我們將αβTCR C區(qū)的近膜莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)替換為CD3ζ全長。我們對(duì)這4種嵌合TCR展開研究,一方面研究這些嵌合TCR分子是否能夠避免與內(nèi)源TCR錯(cuò)配；另一方面由于目前對(duì)于TCR分子各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能尚不是很清楚,我們也期望通過對(duì)結(jié)構(gòu)域替換的嵌合TCR的研究初步探討aβTCR或γδTCR結(jié)構(gòu)域的功能。整個(gè)研究分為4部分進(jìn)行。首先采用分子克隆從健康人外周血中釣取y982TCR和CD3ζ全長,然后運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)α12β7TCR、y982TCR和CD3ζ的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列特點(diǎn)進(jìn)行分析,并進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),初步確定結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn)之后對(duì)嵌合TCR分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并優(yōu)化融合位點(diǎn)；然后針對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn)設(shè)計(jì)了4套重疊PCR引物,克隆并鑒定了攜帶熒光蛋白的嵌合TCR雙表達(dá)載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP以及不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,包裝腺病毒；接著將這些嵌合TCR分子轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞,分析嵌合TCRa和p鏈在細(xì)胞表面的表達(dá)以及配對(duì)組裝能力；最后通過FRET方法分析了chimTCR 與 CD3ζ的相互作用,另外研究了嵌合TCR轉(zhuǎn)T細(xì)胞的CTL效應(yīng)及細(xì)胞因子分泌的能力,通過共定位分析了chim4TCR在T細(xì)胞中信號(hào)初始狀態(tài)。綜上,本課題希望對(duì)結(jié)構(gòu)域替換后的嵌合TCR分子的配對(duì)組裝情況、結(jié)合CD3分子的能力、以及識(shí)別抗原和傳遞活化信號(hào)的能力的研究,為TCR基因修飾T細(xì)胞的過繼性治療研究及其臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。一、yδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學(xué)分析該部分研究目的是確定apTCR, γδTCR, CD3ζ結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn),設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定合理的嵌合TCR分子。在正常人外周血中除了αβT細(xì)胞外(約占CD3+T細(xì)胞的95%),還有一種γδT細(xì)胞(約占CD3+T細(xì)胞的5%)。由于健康人外周血中γδTT細(xì)胞Vγ9鏈總是和Vδ2鏈一起表達(dá)(大多數(shù)健康人的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞占外周血γδT細(xì)胞的50%～95%)。因此我們首先由健康人PBMC分離獲得γδTCR基因類型TCRVy9和TCRVδ2的基因序列,并與實(shí)驗(yàn)室之前分離的αβTCR基因亞型在IMGT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了一級(jí)序列比對(duì)分析。由健康人PBMC分離的CD3ζ采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。應(yīng)用Jpred 和 PredietionProtein服務(wù)器預(yù)測(cè)TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的二級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用TMHMM等5種跨膜程序預(yù)測(cè)TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Swiss-Model在線服務(wù)同源模建法進(jìn)行TCRα12、β7、γ9和δ2三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。最后應(yīng)用Swiss-Model搜索出的比分最高的模板,采用軟件Modeller9V7對(duì)嵌合TCR分子進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬,并與原αβTCR分子之間的蛋白骨架以及抗原識(shí)別活性部位進(jìn)行了空間結(jié)構(gòu)比對(duì)和空間位置分析。結(jié)果IMGT數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析確定了我們篩選分離獲得的TCRα12、β7、γ9和δ2鏈V-D-J或V-J連接區(qū)基因共同編碼的CDR3高變區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示在V結(jié)構(gòu)域的CDR3高變區(qū)后都存在一個(gè)折疊區(qū)域,之后以一段loop形式與TCR的C區(qū)結(jié)構(gòu)域相連接。綜合比較幾種跨膜軟件預(yù)測(cè)結(jié)果,確定了TCRα12、β7、γ9、δ2和CD3ζ的跨膜區(qū)域。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCRα12與TCRδ2結(jié)構(gòu)的同源性較高,TCRβ7和TCRγ9結(jié)構(gòu)的同源性較高,并與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較最終確定了結(jié)構(gòu)域替換的位點(diǎn)。對(duì)嵌合TCR分子的三維建模結(jié)果顯示,嵌合TCR分子能維持原αβTCR蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此,該部分通過生物信息學(xué)分析確定了結(jié)構(gòu)域替換位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)了4種嵌合TCR分子,且這些嵌合TCR分子的結(jié)構(gòu)域具有良好的穩(wěn)定性。二、嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝本部分的研究目的是構(gòu)建一組可用于FRET檢測(cè)的含熒光蛋白的嵌合TCR分子雙表達(dá)載體,以及一組不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出具有感染能力的腺病毒。我們針對(duì)第一章確定的結(jié)構(gòu)域融合位點(diǎn)采用primer premier5.0和Oligo6.0成功設(shè)計(jì)了4套重疊PCR引物。通過重疊PCR一步法獲得chimTRA-CFP和chimTRB-YFP融合基因。chimTRA-CFP經(jīng)BstX Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切插入質(zhì)粒pIRES2-EGFP的IRES下游替換EGFP蛋白獲得重組質(zhì)粒pIRES2-chimTRA/CFP； chimTRB-YFP經(jīng)Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切插入上述重組質(zhì)粒pIRES2-chimTRA/CFP中IRES上游的多克隆位點(diǎn),得到重組雙表達(dá)載體pIRES2-chimTRB/YFP-chimTRA/CFP,并進(jìn)行測(cè)序鑒定。以同樣的方法構(gòu)建不含熒光蛋白的腺病毒雙表達(dá)載體pIRES2-chimTRB-chimTRA,然后將chimTRB-IRES-chimTRA表達(dá)盒插入質(zhì)粒pDC315中,獲得嵌合TCR的重組腺病毒穿梭載體pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA, 并進(jìn)行測(cè)序鑒定。將pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA與Ad5/F35重組嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒 pBHGIoxdeE 1 Cre共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞進(jìn)行嵌合TCR重組腺病毒的包裝,并采用TCID50方法進(jìn)行滴度測(cè)定,通過PCR對(duì)各重組腺病毒基因組進(jìn)行檢測(cè),轉(zhuǎn)染Jukat細(xì)胞后流式鑒定嵌合TCR的表達(dá)及摸索最佳感染復(fù)數(shù)和感染時(shí)間。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。應(yīng)用SPSS(?) v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng),采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析進(jìn)行單因素分析,多重比較使用LSD法。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果成功設(shè)計(jì)了4套重疊PCR引物,并通過重疊PCR一步法成功獲得chimTCRa 和 chimTCRβ的融合基因；成功構(gòu)建了4種含熒光蛋白的真核雙表達(dá)載體pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP;成功構(gòu)建了4種不含熒光蛋白的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-chimTRB-IRES-chimTRA,并包裝出了具有感染能力的重組腺病毒,通過PCR驗(yàn)證chimTCRs整合至病毒基因組中；4種重組嵌合腺病毒的滴度都在109IU/ml以上,并可有效轉(zhuǎn)染Jukat細(xì)胞,以MOI=100 (PFU)感染時(shí)間為48h時(shí),嵌合TCR的表達(dá)效率最高。因此,本部分成功構(gòu)建了含熒光蛋白的4種嵌合TCR分子的雙表達(dá)載體,另外成功構(gòu)建了不含熒光蛋白的嵌合TCR腺病毒穿梭載體并包裝出了具有感染能力的重組嵌合腺病毒。三、嵌合TCR分子的表達(dá)和配對(duì)組裝分析本部分的目的是研究嵌合TCR分子在受體細(xì)胞的表達(dá)水平、自身的配對(duì)能力以及與內(nèi)源TCR分子的錯(cuò)配程度。將這4種攜帶熒光蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-chimTRBYFP-chimTRACFP轉(zhuǎn)染BEL-7402和Jurkat細(xì)胞,并通過激光掃描共聚焦顯微鏡掃描轉(zhuǎn)染細(xì)胞,其中458nm激發(fā)波長激發(fā)供體chimTRACFP.515 nm激發(fā)波長激發(fā)受體chimTRBYFP,然后掃描細(xì)胞獲得熒光圖像,其中掃描ECFP通道獲得青色熒光圖象,EYFP通道獲得黃色熒光圖象。然后利用致敏受體發(fā)射方法(sensitized acceptor emission method, SE)進(jìn)行分析獲得pFRET和FRET效率熒光圖片,接著每個(gè)樣本選擇4組細(xì)胞的FRET效率熒光圖片,并在每組細(xì)胞FRET效率熒光圖片上隨機(jī)選取5個(gè)興趣點(diǎn)(ROI)的熒光值進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較各嵌合TCR分子的相互作用,確定其與內(nèi)源TCR的錯(cuò)配情況。將4種不攜帶熒光蛋白的嵌合TCR重組腺病毒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,72h后收獲細(xì)胞,并以TCRVp7-PE、TCR Va12-FITC抗體染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各嵌合TCR分子Vβ7和Vα12的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。應(yīng)用SPSS(?) v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。兩因素兩水平數(shù)據(jù)比較采用2×2析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng),采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析進(jìn)行單因素分析,多重比較使用LSD法。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示4種攜帶熒光蛋白的嵌合TCR分子能定位于細(xì)胞膜表面并正常表達(dá),特別是chim4TCR在沒有CD3分子存在的情況下也能非常強(qiáng)烈的表達(dá)于細(xì)胞表面,這意味著chim4TCR在細(xì)胞中的表達(dá)可以不依賴于CD3分子。SE-FRET以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),chim1TCR 和 chim2TCR在兩種細(xì)胞的FRET效率都高于wtTCR,但是依然與內(nèi)源TCR產(chǎn)生了少量的雜合TCR分子。雖然chim1TCR和chim2TC R在Jurkat細(xì)胞中不能避免錯(cuò)配,但相比于、vtTC R在一定程度上減少了錯(cuò)配。chim3TCR和chim4TCR在BEL-7402細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的FRET效率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這提示chim3TCR和chim4TCR能避免錯(cuò)配。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)chimlTCR、chim2TCR 和 chim4TCR在Jurkat細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于wtTCR,而chim3TCR在Jurkat細(xì)胞表面的表達(dá)效率最低,特別是chim4TCR相比于未經(jīng)改造的wtTCR及其他3種嵌合TCR其表面表達(dá)水平大大提高。因此,該部分研究表明chim4TCR不僅能夠避免與內(nèi)源TCR的錯(cuò)配,且其在T細(xì)胞系以及非T細(xì)胞系表面表達(dá)水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另3種chimTCR分子和wtTCR分子。chim3TCR雖然能避免錯(cuò)配但是表達(dá)水平卻相比于wtTCR有所下降。chim1TCR 和 chim2TCR其表達(dá)相比于wtTCR稍有提高但是不能避免錯(cuò)配。四、嵌合TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞功能的研究該部分的目的是研究各chimTCR分子與CD3ζ的相互作用及信號(hào)傳遞能力,分析各chimTCR分子轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL效應(yīng)及細(xì)胞因子分泌情況以探討其抗原識(shí)別能力,最后檢測(cè)了chim4TCR在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)初始狀態(tài)。通過第一章生物信息學(xué)分析的各TCR與CD3ζ的跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域,設(shè)計(jì)了能采用FRET方法分析TCR與CD3ζ相互作用的一對(duì)攜帶熒光蛋白的質(zhì)粒。構(gòu)建了作為供體的4種pIRES-chimTRB-chimTRACFP質(zhì)粒和作為受體的pIRES-CD3ζTMYFP 和 pIRES-CD3ζFP重組質(zhì)粒。將以上質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞,激光共聚焦掃描顯微鏡掃描CFP和YFP在BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),SE-FRET分析嵌合TCR與CD3ζ的相互作用。分離健康人PBMC,并篩選出HLA-A2+陽性樣本,將、vtTCR及4種chimTCR的重組腺病毒轉(zhuǎn)染PBMC并設(shè)未轉(zhuǎn)染TCR對(duì)照組,72h后與HLA-A2-的靶細(xì)胞HepG-2, Huh-1以及HLA-A2"的靶細(xì)胞BEL-7402以效靶比30：1～1：1共孵育,作用4h后采用鈣黃綠素(Calcein-acetoxymethyl, CAM)釋放法檢測(cè)各組TCR轉(zhuǎn)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；24h后ELISA檢測(cè)各組TCR轉(zhuǎn)PBMC的IFN-γ分泌水平。最后分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒chim4TCRYFP或CD3ζYFP至BEL-7402和Jurkat細(xì)胞,采用DiD對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行染色,激光共聚焦掃描顯微鏡以515 nm激發(fā)波長和635nm激發(fā)波長分別激發(fā)YFP和DiD,發(fā)射波長由500nm-700nm掃描細(xì)胞獲得熒光圖像,之后通過細(xì)胞膜共定位分析chim4TCR在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)初始狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。應(yīng)用SPSS() v19.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性及Levene's test方差齊性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計(jì),分析兩種干預(yù)交互作用、單獨(dú)效應(yīng)及主效應(yīng)。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)完成單因素?cái)?shù)據(jù)分析,多重比較使用LSD法。當(dāng)P0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示wtTCR和前3種嵌合γδTCR的chimTCR分子與CD3ζTM的FRET效率較低,提示這些TCR與CD3ζ在BEL-7402細(xì)胞中的相互作用較弱。而chim4TCR與CD3ζ能明顯檢測(cè)到FRET,提示chim4TCR中融合的CD3ζ依然能與CD3ζ有一定的相互作用,但是其程度低于chim4TCRαζ和 chim4TCRPβζ之間的相互作用。另外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明chim4TCR、chim1TCR 和 wtTCR轉(zhuǎn)染PBMC細(xì)胞能有效殺傷HLA-A2+的靶細(xì)胞,其中chim4TCR對(duì)靶細(xì)胞的裂解能力高于chim1TCR和wtTCR。但是chim2TCR和chim3TCR轉(zhuǎn)PBMC與未轉(zhuǎn)TCR的PBMC對(duì)HLA-A2+的靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示chim2TCR和chim3TCR可能在識(shí)別特異性抗原或信號(hào)傳遞方面能力受損。各組chimTCRs以及、vtTC R轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)HLA-A2-的靶細(xì)胞沒有表現(xiàn)出殺傷效應(yīng)。此外作用于HLA-A2+的靶細(xì)胞后,chim4TCR、wtTCR和chim1TCR基因轉(zhuǎn)染PBMC能分泌的IFN-γ,其中chim4TCR基因轉(zhuǎn)染組分泌的IFN-γ高于wtTCR 和 chim1TCR基因轉(zhuǎn)染組,而chim2TCR和chim3TCR與未經(jīng)轉(zhuǎn)染TCR的對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作用于HLA-A2-的靶細(xì)胞BEL-7402后,IFN-γ分泌水平均沒有顯著性差異。最后通過細(xì)胞膜共定位分析發(fā)現(xiàn)Chim4TCR或CD3ζ都共定位于膜上,確定了Chim4TCR在T細(xì)胞內(nèi)信號(hào)屬于未活化的初始狀態(tài)。因此,該部分研究證實(shí)Chim4TCR依然能與CD3ζ有一定的相互作用；Chim4TCR、chim1TCR依然保持原wtTCR的HLA-A2限制性,并具有良好的抗原特異性及信號(hào)傳遞能力,chim2TCR 和 chim3TCR可能失去了抗原識(shí)別能力或是信號(hào)傳遞能力受損而不足以促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；另外chim4TCR在T細(xì)胞中的信號(hào)狀態(tài)是可控的。
【關(guān)鍵詞】：TCR基因治療 錯(cuò)配 嵌合TCR γδTCR CD3ζ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R450
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-41
• 參考文獻(xiàn)35-41
• 第一章 γδTCR基因的獲取及嵌合TCR分子生物信息學(xué)分析41-60
• 引言41-42
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料42-44
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 1.3 結(jié)果46-57
• 1.4 討論57-58
• 小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-60
• 第二章 嵌合TCR分子的克隆以及腺病毒的包裝60-95
• 引言60-61
• 2.1 材料與設(shè)備61-63
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法63-80
• 2.3 結(jié)果80-91
• 2.4 討論91-92
• 小結(jié)92-93
• 參考文獻(xiàn)93-95
• 第三章 嵌合TCR分子的表達(dá)和配對(duì)組裝分析95-113
• 引言95-96
• 3.1 材料與設(shè)備96-97
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法97-103
• 3.3 結(jié)果103-108
• 3.4 討論108-110
• 小結(jié)110-111
• 參考文獻(xiàn)111-113
• 第四章 嵌合TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞功能的研究113-154
• 引言113-115
• 4.1 材料與設(shè)備115-116
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法116-124
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果124-145
• 4.4 討論145-149
• 小結(jié)149-151
• 參考文獻(xiàn)151-154
• 研究展望154-155
• 附錄155-158
• 攻讀博士學(xué)位期間成果158-159
• 致謝159-161
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明161

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本文編號(hào)：1107254