本文關(guān)鍵詞：Ⅱ型抗CD20抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤死亡的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Ⅱ型抗CD20抗體 程序可控性壞死 TNFR 溶酶體依賴的細(xì)胞死亡

【摘要】：研究背景與研究目的非霍奇金淋巴瘤是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi)高發(fā)。每年新增病例約385000余例,死亡人數(shù)約199630。非霍奇金淋巴瘤在男女發(fā)病比例中分列第8位和第11位,占腫瘤年發(fā)病率的5.1%,腫瘤死亡率的2.7%。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的GLOBOCAN2012年的數(shù)據(jù),該疾病是發(fā)達(dá)國家中死亡的首要原因,發(fā)展中國家第二重要的原因。2012年世界范圍內(nèi)約8.3萬人死亡。非霍奇金淋巴瘤在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高,在發(fā)展中國家,惡性非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率有逐年增高的趨勢,如泰國及中國。非霍奇金淋巴瘤中80%為B細(xì)胞表型,剩余為T細(xì)胞表型。CD20分子是細(xì)胞膜表面標(biāo)志物,B細(xì)胞分化抗原。主要表達(dá)于前B細(xì)胞,成熟B細(xì)胞及多數(shù)惡性B淋巴細(xì)胞表面,而在造血干細(xì)胞、漿細(xì)胞和其他正常組織表面并不表達(dá)。CD20分子是治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶標(biāo)。因?yàn)镃D20分子在細(xì)胞膜上比較暴露,且在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)水平較高,這使得利妥昔或者奧法木此類單克隆抗體比較容易接近并結(jié)合,同時(shí),CD20分子與單克隆抗體結(jié)合后,沒有顯著的內(nèi)吞及脫落現(xiàn)象。這使得單克隆抗體可以長時(shí)間存在于細(xì)胞膜表面,長期提供由補(bǔ)體及FCR表達(dá)引起的持續(xù)性免疫攻擊,特別是來自巨噬細(xì)胞的免疫效應(yīng)。CD20分子與單克隆抗體結(jié)合后也可以產(chǎn)生跨膜信號,雖然未經(jīng)證實(shí),這可能提供抗CD20單克隆抗體的治療成功的重要原因。這些特點(diǎn)使抗CD20抗體被開發(fā)用于免疫治療,通過殺死正�；蛘邜盒訠細(xì)胞,在治療自身免疫性疾病和惡性腫瘤方面取得了顯著效果。以往的研究表明,抗CD20抗體可能涉及多種機(jī)制提供的治療效果,包括補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用(CDC),抗體依賴性細(xì)胞毒性作用(ADCC)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些引起抗腫瘤效應(yīng)的不同的作用機(jī)制目前仍不明確,依然是問題的論點(diǎn)�；贑D20脂筏重新分配功能,抗CD20單克隆抗體可以簡單地分為兩類：Ⅰ型單克隆抗體(利妥昔單抗和大多數(shù)抗CD20抗體),此類單克隆抗體能夠有效地將CD20分子復(fù)合物轉(zhuǎn)脂筏介導(dǎo)CDC效應(yīng),但不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Ⅱ型單克隆抗體(如B1),此類單克隆抗體不能促進(jìn)CD20分子轉(zhuǎn)脂筏,也不能誘導(dǎo)CDC效應(yīng),而是更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這兩種類型的單克隆抗體均可以介導(dǎo)ADCC效應(yīng)及FCR段介導(dǎo)的粒細(xì)胞效應(yīng)�？笴D20單克隆抗體在治療自身免疫疾病和惡性腫瘤中取得的成就使得單抗治療成為新的研究熱點(diǎn)。到目前為止,超過十種單克隆抗體已經(jīng)通過美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,Rituximab(美國IDEC生產(chǎn)C2B8)是以B細(xì)胞表面標(biāo)志物CD20分子為靶點(diǎn),第一個經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或者難治性或者濾泡B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體。利妥昔單抗的成功鼓勵我們進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有的或者尋找新的抗CD20抗體。盡管利妥昔單抗治療B細(xì)胞淋巴瘤臨床效果比較顯著,仍有48%的病人對Rituximab的治療完全反應(yīng)率低于10%。因此,為滿足臨床的提高藥效,增加單抗應(yīng)用范圍的要求,尋求更為有效的抗CD20抗體治療顯得尤為迫切。在本文中,我們將著重討論抗CD20單克隆抗體的殺傷機(jī)制。這些單克隆抗體,尤其是通過對Ⅱ型抗CD20單克隆抗體抗腫瘤機(jī)制研究,驅(qū)動免疫治療,導(dǎo)致細(xì)胞死亡的研究機(jī)制討論其可能的作用方式,為以后抗體的進(jìn)一步提高和開發(fā)提供思路。研究方法1)利用流式細(xì)胞儀技術(shù)(Flow cytometry),使用細(xì)胞死亡染料對細(xì)胞進(jìn)行染色,體外鑒定細(xì)胞死亡,觀察不同抗體不同濃度情況下引起的細(xì)胞死亡狀況。并利用透射電鏡技術(shù)(TEM, Transmission electron microscope)觀察不同抗體處理后,細(xì)胞的死亡形態(tài),鑒定其死亡形式。2)借助western-blot,檢測細(xì)胞死亡通路的關(guān)鍵蛋白,確定或排除其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的信號通路。并通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)(Confocal immunofluorescence)觀察細(xì)胞各蛋白釋放情況,并通過其對應(yīng)的抑制劑作用確定該蛋白與細(xì)胞死亡的相關(guān)性。3)運(yùn)用免疫共沉淀(Co-IP)的方法,鑒定與CD20分子相關(guān)的蛋白,并運(yùn)用銀染的方法分析CD20復(fù)合物中的蛋白,再利用western-blot的技術(shù)進(jìn)行鑒定。同時(shí)利用其阻斷劑對其信號進(jìn)行阻斷,觀察其作用,能否引起細(xì)胞死亡。并使用慢病毒干擾體系對細(xì)胞系進(jìn)行體外干擾,使該蛋白低表達(dá),使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測其功能,驗(yàn)證還能否引起細(xì)胞死亡。4)從下游通路向上反推,篩選起作用的抑制劑以確定上游信號通路。并運(yùn)用熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)(Confocal immunofluorescence)檢測其蛋白釋放狀況,并通過抑制劑作用后再次驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細(xì)胞死亡并非凋亡,而是壞死：我們使用Ⅰ型抗CD20抗體Rituximab作為對照,Ⅱ型抗CD20抗體11B8以及此前研究中得到的突變型抗體HY102K為研究對象,發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細(xì)胞死亡并不是凋亡,而是一種壞死。且即使在交聯(lián)情況下,Ⅱ型抗CD20抗體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡能力也明顯強(qiáng)于Ⅰ型抗CD20抗體,這種細(xì)胞死亡是濃度依賴的。2)這種細(xì)胞死亡是非Caspase依賴的,而是溶酶體依賴的細(xì)胞死亡：通過westen-blot的檢測,我們發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細(xì)胞死亡是一種非Caspase依賴的細(xì)胞死亡。通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)(Confocal immunofluorescence)檢測,我們發(fā)現(xiàn),這種細(xì)胞死亡是溶酶體依賴(lysosome-dependent)的細(xì)胞死亡。溶酶體破裂后釋放CathepsinB,這種細(xì)胞死亡可以被CathepsinB抑制劑所抑制。3)CD20分子與TNFR共同作用,激活下游通路：通過免疫共沉淀(Co-IP)的方法我們發(fā)現(xiàn)CD20相關(guān)復(fù)合物含有多種蛋白,應(yīng)用銀染和westen-blot的方法,我們鑒定出TNFR與CD20分子天然結(jié)合,并共同激活信號通路,引起下游信號通路變化。我們初步認(rèn)定這種細(xì)胞死亡是程序可控性壞死。運(yùn)用其抑制劑necrosis可以顯著抑制細(xì)胞死亡。TNFR的阻斷劑同時(shí)也可以對抗體引起的細(xì)胞死亡有抑制作用。我們運(yùn)用免疫共沉淀(Co-IP)發(fā)現(xiàn)了多種程序性壞死信號通路上的相關(guān)蛋白,并應(yīng)用westen-blot技術(shù)觀察到了RIP1,RIP3的結(jié)合變化。認(rèn)為只有Ⅱ型抗CD20抗體與CD20分子結(jié)合后可以激活程序性壞死(necroptosis)通路。運(yùn)用慢病毒系統(tǒng)低表達(dá)RIP1后可以觀察到程序性壞死被抑制。4) Ceramide引起下游通路變化：已知細(xì)胞死亡是由溶酶體破裂,釋放CathepsinB后引起細(xì)胞死亡,通過大量抑制劑篩查,并通過流式檢測細(xì)胞死亡情況得知CE內(nèi)化后,FADS7激活sphingolipid-delta-4-desaturase(DES1),使D-erythro-sphinganie轉(zhuǎn)變?yōu)镈erythro-sphingosine(鞘氨醇),結(jié)合于蛋白酶C端,之后引起溶酶體破裂,釋放CathepsinB,最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。并通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)論我們發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細(xì)胞死亡是一種程序可控型壞死而不是凋亡。這種細(xì)胞死亡為非Caspase依賴的,溶酶體依賴的細(xì)胞死亡。Ⅱ型抗CD20抗體與CD20分子結(jié)合后通過與TNFR協(xié)同作用引起下游信號通路變化,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在下游通路上,我們得出的結(jié)果說明,神經(jīng)酰胺在Ⅱ型抗CD20抗體的刺激下內(nèi)化,FADS7泛素化降解激活sphingolipid-delta-4-desaturase,使D-erythro-sphinganie轉(zhuǎn)變?yōu)镈erythro-sphgosine,結(jié)合于組織蛋白酶特定的C區(qū)并激活,之后引起溶酶體破裂,釋放CathepsinB,最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。本文詳細(xì)說明了Ⅱ型抗CD20抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制,并首次提出了CD20與TNFR共同傳導(dǎo)信號的模型,為臨床應(yīng)用Ⅱ型抗CD20抗體治療淋巴瘤提供了理論依據(jù),解釋了其信號傳導(dǎo)通路。希望能為今后設(shè)計(jì)更好的治療淋巴瘤的抗體藥物和設(shè)計(jì)更合適的聯(lián)合用藥方法提供思路。
【關(guān)鍵詞】：Ⅱ型抗CD20抗體 程序可控性壞死 TNFR 溶酶體依賴的細(xì)胞死亡
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 縮略詞表14-16
• 前言16-19
• 第一部分 Ⅱ型抗CD20抗體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡19-32
• 一、實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 二、實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-30
• 四、討論30-32
• 第二部分 Ⅱ型抗體誘導(dǎo)Caspase非依賴的壞死32-57
• 一、實(shí)驗(yàn)材料33-37
• 二、實(shí)驗(yàn)方法37-46
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-54
• 四、討論54-57
• 第三部分 CD20與TNFR的協(xié)同作用57-69
• 一、實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 二、實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-66
• 四、討論66-69
• 第四部分 Ceramide在細(xì)胞死亡中的重要作用69-78
• 一、實(shí)驗(yàn)材料70-71
• 二、實(shí)驗(yàn)方法71-72
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果72-76
• 四、討論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 全文小結(jié)85-86
• 綜述 受體相關(guān)蛋白酶（RIP)在細(xì)胞存亡中的作用86-94
• 參考文獻(xiàn)92-94
• 綜述 抗CD20抗體治療淋巴瘤治療進(jìn)展94-109
• 參考文獻(xiàn)100-109
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109-110
• 致謝110

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本文編號：1109117