本文關(guān)鍵詞：綿羊程序性細胞死亡因子10（PDCD10）克隆、表達及功能研究

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【摘要】：布魯氏菌病是由布魯氏桿菌(Brucella)引起的一種世界范圍的人獸共患傳染病，嚴(yán)重威脅人類健康和社會公共衛(wèi)生安全。目前，布病的臨床診斷主要依賴于血清學(xué)檢測，該方法很難區(qū)分布魯氏菌自然感染動物和疫苗接種動物，嚴(yán)重影響了布病的診斷及監(jiān)控。因此，有必要建立一種能夠區(qū)分布魯氏菌自然感染與疫苗接種動物的鑒別診斷方法，這對于布病的防控和凈化具有重要意義。針對該問題，本課題組前期構(gòu)建了綿羊響應(yīng)布魯氏菌強弱毒株感染白細胞層SSHcDNA文庫，并篩選獲得了差異表達基因PDCD10。因此，本研究擬從克隆綿羊程序性細胞死亡因子10（簡寫為OaPDCD10）全長cDNA序列入手，分析其在布魯氏菌感染羊和疫苗接種羊間的差異表達情況，并利用RNAi技術(shù)研究該蛋白的生物學(xué)功能。旨為進一步闡明OaPDCD10與布病發(fā)生的關(guān)系、尋找鑒別布魯氏菌自然感染與疫苗接種動物的診斷標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。為此，本文主要對以下幾個方面進行了研究： 一、OaPDCD10基因全長cDNA的克隆及序列分析 根據(jù)已獲得的OaPDCD10部分mRNA序列，采用RACE技術(shù)對其全長cDNA序列進行擴增，并用相應(yīng)的軟件進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：OaPDCD10全長cDNA序列為1343bp，GenBank登錄號為KC425616。其中5’-非編碼區(qū)（untranslated region，UTR)為273bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）為639bp，3’-UTR為431bp（包括poly A尾巴結(jié)構(gòu)）。ORF被預(yù)測編碼212個氨基酸殘基，預(yù)測的蛋白分子量（MW）為24.71kDa、等電點（pI）為8.20。多重比對分析表明，PDCD10是一個高度保守的蛋白，OaPDCD10與鼠的（GenBank登錄號：NP_062719)氨基酸序列同源性最高，為100%。另外，OaPDCD10被預(yù)測是由7個-螺旋緊密壓縮構(gòu)成的接頭蛋白，有5個Ser磷酸化位點、無催化結(jié)構(gòu)域、無跨膜結(jié)構(gòu)域、無信號肽。 二、OaPDCD10基因差異表達的驗證及分析 根據(jù)已獲得的OaPDCD10全長cDNA序列設(shè)計引物，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)分析OaPDCD10mRNA的組織分布，驗證OaPDCD10mRNA在布魯氏菌感染羊和疫苗接種羊間的差異表達情況。組織分布結(jié)果表明，OaPDCD10mRNA在所有檢測的組織中都有表達，其在心臟中的表達量最高，其次是瘤胃、腎、肝、脾和骨骼肌，而在肺、白細胞層及小腸中的表達量最低，且三者之間沒有顯著性差異。差異分析結(jié)果表明，感染組和疫苗組的OaPDCD10mRNA均以時間依賴的方式逐漸上調(diào)表達(p0.05或p0.01)，，且疫苗組要高于感染組。在接種細菌30d后，OaPDCD10mRNA在疫苗組和感染組間存在顯著(*p0.05)或極顯著(**p0.01)差異。提示OaPDCD10在布魯氏菌病發(fā)生過程中很可能發(fā)揮重要的作用。 三、OaPDCD10的原核表達、純化及特性 本研究構(gòu)建了OaPDCD10原核表達載體pET30a-OaPDCD10，并對其進行誘導(dǎo)表達和純化。結(jié)果表明，在28℃、0.4mM IPTG誘導(dǎo)4h的條件下，重組OaPDCD10蛋白（rOaPDCD10）誘導(dǎo)表達量最高。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗證，rOaPDCD10大小約為28kDa，比預(yù)測的24.71kDa略大些。純化的rOaPDCD10蛋白條帶單一，濃度為0.4mg/ml。為了初步驗證rOaPDCD10的生物學(xué)活性，我們以293T細胞為研究對象，觀察純化的rOaPDCD10對293T細胞的增殖及凋亡的影響。結(jié)果表明，將純化的rOaPDCD10（50μg/ml）作用于293T細胞12h、24h、36h后，處理組的細胞凋亡率隨著時間的延長而逐漸降低，分別為89.07%、86.85%、84.22%，但均高于空白對照組（77.89%）。MTT結(jié)果表明，與空白對照組相比，純化的rOaPDCD10（50μg/ml）處理組的293T細胞的活力顯著增強（p0.05or p0.01）。表明純化的rOaPDCD10具有誘導(dǎo)細胞凋亡、促進細胞增殖的能力，但細胞的凋亡率隨著時間的延長卻逐漸下降。 四、OaPDCD10單克隆抗體的制備 本研究以純化的rOaPDCD10為免疫原免疫小鼠，采用經(jīng)典的淋巴細胞融合技術(shù)進行細胞融合，利用間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞株，最終成功地獲得了兩株穩(wěn)定分泌抗OaPDCD10單克隆抗體的雜交瘤細胞株。而且，抗OaPDCD10的單克隆抗體特異性好，能夠與重組的、天然的OaPDCD10蛋白特異性結(jié)合。 五、OaPDCD10過表達對細胞增殖及凋亡的影響 為了闡明OaPDCD10的生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了真核過表達載體pLV5-OaPDCD10-GFP，轉(zhuǎn)染293T細胞，觀察OaPDCD10過表達對細胞增殖及凋亡的影響。采用Western blot技術(shù)分析OaPDCD10的蛋白表達，MTT法檢測細胞生長情況，hoechst33342/PI染色形態(tài)學(xué)法及AnnexinⅤ染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后48h，OaPDCD10過表達組中OaPDCD10蛋白的表達量顯著增高（p0.05），是空白對照組的1.55倍。與空白對照組相比，OaPDCD10-GFP轉(zhuǎn)染組的293T細胞活力顯著增強（p0.05）。而OaPDCD10-GFP轉(zhuǎn)染組的293T細胞凋亡率為81.3%，低于陰性對照組（GFP）（85.37%），但仍高于空白對照組（77.89%），表明OaPDCD10過表達能夠促進細胞的增殖而抑制細胞的凋亡。 六、PDCD10沉默對細胞增殖及凋亡的影響 為了進一步確認PDCD10的功能，本研究設(shè)計并構(gòu)建了兩條人羊同源的、靶向PDCD10的shRNA干擾質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染293T細胞，觀察PDCD10表達沉默對細胞增殖及凋亡的影響。采用Western blot技術(shù)分析PDCD10的蛋白表達，MTT法檢測細胞生長情況，hoechst33342/PI染色形態(tài)學(xué)法及AnnexinⅤ染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后48h，與空白對照組相比，sh1和sh2干擾組中PDCD10蛋白的表達分別下調(diào)至76.1%（p0.05）、25.7%（p0.01）。因此，選擇sh2進行后續(xù)的功能驗證。與空白對照組相比，PDCD10干擾組的293T細胞活力顯著降低（p0.01）。而PDCD10干擾組中293T細胞的凋亡率為90.73%，高于陰性對照組（shNC）（84.96%），更高于空白對照組（77.89%），表明PDCD10沉默表達能夠抑制細胞的增殖而促進細胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PDCD10 克隆 差異分析 RNAi 凋亡 增殖 布病
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞表12-17
• 引言17-19
• 第一篇 文獻綜述19-45
• 第1章 布魯氏菌病研究進展19-33
• 1.1 布魯氏菌概述19-20
• 1.2 布魯氏菌致病性20-21
• 1.3 布魯氏菌胞內(nèi)生存機制的研究21-27
• 1.4 布魯氏菌免疫逃逸機制的研究27-31
• 1.5 小結(jié)31-33
• 第2章 PDCD10 研究進展33-39
• 2.1 PDCD10 概述33-34
• 2.2 PDCD10 功能結(jié)構(gòu)域34-35
• 2.3 PDCD10 與凋亡35-36
• 2.4 PDCD10 與血管生成36-37
• 2.5 PDCD10 與腫瘤37
• 2.6 小結(jié)37-39
• 第3章 布魯氏菌與凋亡39-45
• 第二篇 研究內(nèi)容45-127
• 第1章 OaPDCD10 基因全長 cDNA 的克隆及序列分析45-61
• 1.1 材料45-46
• 1.2 方法46-53
• 1.3 結(jié)果53-58
• 1.4 討論58-60
• 1.5 小結(jié)60-61
• 第2章 OaPDCD10 基因差異表達的驗證及分析61-69
• 2.1 材料61-62
• 2.2 方法62-64
• 2.3 結(jié)果64-65
• 2.4 討論65-67
• 2.5 小結(jié)67-69
• 第3章 OaPDCD10 的原核表達、純化及特性69-91
• 3.1 材料69-71
• 3.2 方法71-80
• 3.3 結(jié)果80-88
• 3.4 討論88-90
• 3.5 小結(jié)90-91
• 第4章 OaPDCD10 單克隆抗體的制備91-99
• 4.1 材料91-92
• 4.2 方法92-95
• 4.3 結(jié)果95-97
• 4.4 討論97-98
• 4.5 小結(jié)98-99
• 第5章 OaPDCD10 過表達對細胞增殖及凋亡的影響99-111
• 5.1 材料99-100
• 5.2 方法100-104
• 5.3 結(jié)果104-109
• 5.4 討論109-110
• 5.5 小結(jié)110-111
• 第6章 PDCD10 沉默對細胞增殖及凋亡的影響111-127
• 6.1 材料111-112
• 6.2 方法112-116
• 6.3 結(jié)果116-121
• 6.4 討論121-125
• 6.5 小結(jié)125-127
• 結(jié)論127-129
• 參考文獻129-157
• 導(dǎo)師簡介157-159
• 作者簡介159-161
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文161-163
• 致謝163

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：524656