本文關(guān)鍵詞：苧麻轉(zhuǎn)抗旱基因的功能評(píng)估及抗旱轉(zhuǎn)錄組研究

  更多相關(guān)文章： 苧麻 葉脈 轉(zhuǎn)基因 干旱脅迫 轉(zhuǎn)錄組

【摘要】：苧麻是中國(guó)重要的天然纖維作物之一,且被廣泛種植在印度和其他東南亞和環(huán)太平洋國(guó)家。苧麻的生物產(chǎn)量比較高,長(zhǎng)江流域一年可收獲三季,在雨水充足的菲律賓地區(qū)甚至可以收獲六季。由于研究起點(diǎn)較低、研究人員缺乏等原因,在Gen Bank中注冊(cè)的苧麻EST序列僅421條(截至2015年4月9日),且缺乏可參考的基因組圖譜信息。生物學(xué)信息的缺乏,嚴(yán)重阻礙了苧麻分子生物學(xué)的發(fā)展。本文利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),鑒定到了一些抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)建立的試管苗葉脈的遺傳轉(zhuǎn)化體系。轉(zhuǎn)化了一個(gè)水稻干旱脅迫響應(yīng)的NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子SNAC1,進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子功能的驗(yàn)證。并且對(duì)抗旱材料進(jìn)行了組學(xué)研究。本文的主要結(jié)果如下:1.采用“華苧5號(hào)”試管苗為實(shí)驗(yàn)材料,首次以試管苗葉脈為外植體建立一個(gè)高效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苧麻遺傳轉(zhuǎn)化體系。然后測(cè)定了葉脈再生對(duì)卡那霉素的敏感性,篩選出葉脈遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中選擇培養(yǎng)時(shí)最佳卡那霉素濃度為40 mg L-1。2.優(yōu)化了“華苧5號(hào)”葉脈遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化的一些因素:葉齡、農(nóng)桿菌濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌浸染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度。得到產(chǎn)生最高遺傳轉(zhuǎn)化效率的具體條件為:以取自40 d試管苗苗齡的葉脈為外植體,農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0.6,菌液浸染時(shí)間為10 min,共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度為50 mg L-1,共培養(yǎng)時(shí)間為3d。以上條件能夠達(dá)到的平均轉(zhuǎn)化效率為23.25%。利用GUS和NPTⅡ基因的特異性引物進(jìn)行的PCR檢測(cè)、Southern雜交檢測(cè)、GUS染色組織化學(xué)分析等進(jìn)一步證明了目的基因整合到苧麻基因組并在轉(zhuǎn)基因苧麻中得到表達(dá)。3.利用已建立的苧麻葉脈遺傳轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化了一個(gè)水稻NAC(NAM,ATAF and CUC2)家族的SNAC1基因。對(duì)SNAC1基因不同轉(zhuǎn)基因家系進(jìn)行PCR檢測(cè)。隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因株系1,3,18和20做Southern拷貝數(shù)分析,檢測(cè)結(jié)果顯示SNAC1轉(zhuǎn)基因株系1,3和18為單拷貝的,轉(zhuǎn)基因株系20是雙拷貝的,隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因株系3和20做后續(xù)的分析。熒光定量結(jié)果表達(dá)分析證明,與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因株系3和20目的基因均過(guò)量表達(dá)。4.對(duì)轉(zhuǎn)基因株系3和20三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期即苗期,旺長(zhǎng)期和纖維成熟期的植株做了抗逆性分析。苗期采用10%(w/v)PEG6000模擬干旱脅迫,對(duì)照組是培養(yǎng)在1/2的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中。苗期抗逆性分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系3和20在干旱脅迫處理?xiàng)l件下,鮮重和干重明顯的高于野生型。旺長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)材料的干旱脅迫方法采用飽和灌溉,然后去除多余的水,抑制澆水,進(jìn)而觀察植株的表型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,旺長(zhǎng)期脅迫后,轉(zhuǎn)基因家系比野生型植株的凈光合速率、葉片相對(duì)含水量、脯氨酸、POD活性高,而丙二醛的含量則較低。干旱脅迫纖維成熟期的材料,其地上部分鮮重、鮮莖重、鮮皮重、干皮重,均比野生型植株高。綜上所述,轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有較強(qiáng)的抗旱性。5.本項(xiàng)研究中,對(duì)干旱脅迫的“華苧5號(hào)”利用15%(w/v)PEG6000進(jìn)行干旱脅迫。對(duì)處理(0h,12h,24h,48和72h)的葉片進(jìn)行葉片相對(duì)含水量、脯氨酸、丙二醛和POD活性測(cè)定。根據(jù)這些生理指標(biāo)的變化規(guī)律分析,選擇干旱脅迫處理0h,24h和72h的葉片和根提取RNA。獲取c DNA集合,并利用Illumina配對(duì)末端測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,從而產(chǎn)生1.7億個(gè)原始測(cè)序讀長(zhǎng)。在經(jīng)PEG處理24h(L2和R2)和72h(L3和R3)的葉和根中共有16,798個(gè)基因差異性表達(dá),其中,葉片中有9,281個(gè),根中有8,627個(gè)。在這些基因中,來(lái)自AP2(3)、MYB(6)、NAC(9)、zinc finger(5)及b ZIP(2)家族的25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TFs)被認(rèn)為與干旱脅迫相關(guān)。我們將進(jìn)一步研究這些轉(zhuǎn)錄因子在苧麻抗旱中的作用及其機(jī)理。
【關(guān)鍵詞】：苧麻 葉脈 轉(zhuǎn)基因 干旱脅迫 轉(zhuǎn)錄組
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S563.1
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1 苧麻抗旱研究13-16
• 1.1 干旱脅迫對(duì)植物的影響13-14
• 1.2 植物的抗旱機(jī)制14-15
• 1.3 苧麻的抗旱研究進(jìn)展15-16
• 2 苧麻轉(zhuǎn)基因研究16-18
• 2.1 轉(zhuǎn)基因作物的研究16
• 2.2 轉(zhuǎn)基因苧麻的研究16-18
• 3 苧麻轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究18-20
• 3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物上的應(yīng)用18-19
• 3.2 苧麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究19-20
• 4 本課題的提出20-22
• 第二章 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)苧麻葉脈遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立22-40
• 1 前言22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法23-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 3 結(jié)果與分析28-38
• 3.1 苧麻葉脈外植體的再生對(duì)Km的敏感性28-29
• 3.2 影響轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)化及再生效率因子的優(yōu)化29-32
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生32-34
• 3.4 轉(zhuǎn)基因苧麻植株的分子檢測(cè)分析34-38
• 4 討論38-40
• 4.1 以葉脈為外植體的苧麻遺傳轉(zhuǎn)化38-39
• 4.2 以苧麻葉脈為外植體的苧麻遺傳轉(zhuǎn)化主要影響因子39-40
• 第三章 水稻SNAC1 基因?qū)ζr麻的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗逆性研究40-59
• 1 前言40-41
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法41-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-46
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析46-57
• 3.1 SNAC1 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)46-47
• 3.2 SNAC1 基因的表達(dá)增強(qiáng)了苗期材料的抗旱耐鹽性47-49
• 3.3 SNAC1 基因的表達(dá)增強(qiáng)了旺長(zhǎng)期材料的抗旱耐鹽性49-52
• 3.4 SNAC1 基因表達(dá)增強(qiáng)了纖維成熟期苧麻材料的抗旱耐鹽性52-54
• 3.5 復(fù)水處理對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型苧麻植物的影響54-57
• 4 討論57-59
• 4.1 SNAC1 基因在苧麻抗逆育種中的應(yīng)用價(jià)值57-58
• 4.2 SNAC1 轉(zhuǎn)基因植株抗逆性的分析58-59
• 第四章 PEG模擬干旱條件下的苧麻轉(zhuǎn)錄組分析59-77
• 1 前言59-60
• 2 材料和方法60-64
• 2.1 植株材料的準(zhǔn)備、RNA的提取及cDNA文庫(kù)的建立60-61
• 2.2 序列的拼接、注釋及GO Terms/KEGG通路的建立61
• 2.3 差異表達(dá)的冗余性和富集性分析61-62
• 2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR62-64
• 2.5 RWC、MDA、脯氨酸含量和POD值的測(cè)定64
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-72
• 3.1 苧麻對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)64-65
• 3.2 Illumina測(cè)序、讀取拼接及注釋65-67
• 3.3 功能性分類與代謝途徑分配67-68
• 3.4 基因差異性表達(dá)分析68-69
• 3.5 響應(yīng)干旱轉(zhuǎn)錄因子的確定69-72
• 4 討論72-77
• 4.1 PEG處理下生理指標(biāo)的變化72-73
• 4.2 苧麻響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子的五個(gè)主要家族73-77
• 第五章 展望77-79
• 1.多種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立77
• 2. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子后期功能驗(yàn)證77
• 3. 苧麻抗旱蛋白質(zhì)組學(xué)77-79
• 參考文獻(xiàn)79-94
• 附錄A94-98
• 附錄B 攻讀博士期間撰寫(xiě)及發(fā)表論文情況98-100
• 致謝100-101

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉飛虎,梁雪妮,張壽文;運(yùn)用生理生化、形態(tài)解剖指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)苧麻抗旱性[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2001年03期

2 胡立勇,聶先舟,汪在芹,陳秋珍;傜麻不同品種(系)抗旱性的測(cè)定及其水分生理研究[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1993年03期

3 劉飛虎,梁雪妮,張壽文,黃海輝;干旱脅迫下苧麻種質(zhì)的生理生化特性研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年01期

4 陳作舟,薛成海,朱晟,周豐豐,XUEFENG BRUCE LING,劉國(guó)平,陳良標(biāo);GoPipe:批量序列的Gene Ontology注釋和統(tǒng)計(jì)分析(英文)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2005年02期

5 揭雨成,黃丕生,李宗道;苧麻基因型抗旱性差異及其早期鑒定研究[J];作物學(xué)報(bào);2000年06期

6 符家平;汪波;劉立軍;楊金雨;王緒霞;邢秀龍;彭定祥;;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt基因苧麻的獲得及其抗蟲(chóng)鑒定[J];作物學(xué)報(bào);2009年10期

7 彭定祥;;干旱和淹水對(duì)苧麻生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J];中國(guó)麻作;1992年04期

8 張波,鄭長(zhǎng)清,林華如;干旱脅迫下苧麻種質(zhì)的抗旱生理與經(jīng)濟(jì)性狀的研究[J];中國(guó)麻作;1997年01期

9 揭雨成,李宗道,黃丕生;苧麻抗旱機(jī)理研究現(xiàn)狀與展望[J];中國(guó)麻作;1997年04期

10 揭雨成,冷鵑,許英;干旱脅迫下苧麻葉片萎蔫程度、相對(duì)含水量與ABA變化的品種間差異[J];中國(guó)麻業(yè);2002年01期

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本文編號(hào)：530090