發(fā)布時間：2017-07-06 03:14

  本文關(guān)鍵詞：IBV感染雞腎臟和脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及雞IFITM1抑制IBV和NDV復(fù)制機制的研究

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【摘要】：雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原,二者引起急性、高度傳染性禽呼吸道疾病,威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了IBV感染后宿主脾臟和腎臟中全基因的差異表達情況,借以嘗試揭示IBV的致病機制和宿主的抗病毒機制。我們比較分析了IBV感染早期和晚期脾臟基因差異表達情況。結(jié)果表明脾臟作為重要免疫器官參與了宿主對IBV的免疫反應(yīng),在IBV感染早期激發(fā)的免疫反應(yīng)要強于感染晚期,IBV感染晚期誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)要強于感染早期。在IBV感染致死雞的腎臟中共有1777個差異表達基因;其中包括干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1(IFITM1)在內(nèi)的103個免疫和炎癥相關(guān)基因顯著差異表達這103個免疫和炎癥相關(guān)基因能夠組成一個以IL6,STAT1,MYD88,IRF1和NFKB2為中心的相互作用網(wǎng)絡(luò)。提示這些基因可能在宿主抵抗IBV感染過程中發(fā)揮重要作用。對差異表達基因進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示差異表達基因主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞粘附、能量代謝、細胞因子通路、免疫反應(yīng)、凋亡調(diào)節(jié)等生物進程。我們首次對IBV感染雞的腎臟和脾臟進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,研究結(jié)果為進一步深入了解宿主的抗病毒機制和IBV的致病機制提供了素材。IFITM是一類重要的抗病毒因子,我們在進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)ch IFITM1(LOC422993)在IBV感染的腎臟中顯著上調(diào)表達。人源和鼠源IFITM蛋白通過定位在細胞膜或細胞內(nèi)體膜上限制SARS-Co V、流感病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒等多種病毒的侵入,但雞源IFITM1(ch IFITM1)在病毒感染中的潛在作用尚未見報道。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Gen Bank中標(biāo)注為IFITM3的基因(LOC422993)含有IFITM家族特有的CD225保守結(jié)構(gòu)域,因此LOC422993屬于IFITM家族;但LOC422993缺失YXX?氨基酸基序,YXX?氨基酸基序的缺失是人源、鼠源、豬源IFITM1蛋白的共性,因此我們認為LOC422993為雞源IFITM1而非IFITM3。通過熒光定量RT-PCR檢測ch IFITM1基因的體內(nèi)外分布情況時發(fā)現(xiàn)該基因在各組織分布差別很大,腎臟、氣管和肺臟在轉(zhuǎn)錄水平幾乎檢測不到ch IFITM 1的表達,只有個別雞檢測到低拷貝表達;脾臟、胸腺和腺胃的表達量也較低,而消化道、法氏囊、肝臟和胰腺的表達量較高。同時體外培養(yǎng)的DF1和LMH細胞在轉(zhuǎn)錄水平檢測不到ch IFITM 1的表達;CEF細胞中有微弱表達,推測可能是在制備細胞過程中腸道等ch IFITM 1高表達組織未能完全去除所致。進一步研究發(fā)現(xiàn)在IBV感染致死雞的靶器官氣管和腎臟中ch IFITM1 m RNA顯著上調(diào)表達,其中在腎臟中的上調(diào)倍數(shù)高于氣管中的上調(diào)倍數(shù),ch IFITM1在其它6株IBV分離毒株感染致死雞腎臟組織中同樣上調(diào)表達,證實不同IBV毒株的感染普遍誘導(dǎo)ch IFITM1上調(diào)表達;鑒于自然狀態(tài)下氣管和腎臟中幾乎檢測不到ch IFITM1的表達,因此ch IFITM1在IBV靶器官氣管和腎臟中屬于病毒誘導(dǎo)型表達。同為禽呼吸道病毒的NDV感染24h就能在氣管中誘導(dǎo)ch IFITM1上調(diào)表達,說明ch IFITM1較早地參與了機體抗病毒反應(yīng)。NDV感染致死雞的腎臟、氣管和腺胃中ch IFITM1同樣顯著上調(diào)表達,說明IBV和NDV在體內(nèi)誘導(dǎo)ch IFITM1表達方面具有相似性。體外過表達ch IFITM1發(fā)現(xiàn)該蛋白顯著抑制NDV的復(fù)制。為了進一步鑒定ch IFITM1發(fā)揮抗病毒作用的區(qū)域,我們通過生物信息學(xué)方法預(yù)測ch IFITM1具有N端和C兩個膜外區(qū),分別缺失N端35個氨基酸和C端7個氨基酸,發(fā)現(xiàn)ch IFITM1 C端雖僅有7個氨基酸,但C端的缺失使得ch IFITM1極大地喪失了抑制NDV復(fù)制的能力。我們通過激光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)與人源IFITM1不同,ch IFITM1蛋白并沒有定位于細胞外膜而是位于細胞漿中,但并沒有與內(nèi)體標(biāo)志物L(fēng)AMP1共定位。以往的觀點認為IFITM蛋白通過定位在細胞膜或內(nèi)體膜上阻止病毒侵入從而發(fā)揮抗病毒作用,鑒于ch IFITM1的獨特定位情況,我們推測ch IFITM1可能與已報到的人源和鼠源IFITM蛋白不同,具有獨特的抗病毒機制。我們嘗試從蛋白相互作用角度探究ch IFITM1蛋白獨特的抗病毒機制,Pull-down實驗證實ch IFITM1能夠與EIF5A1在體外相互作用,進一步研究發(fā)現(xiàn)EIF5A1同樣具有抑制NDV復(fù)制的能力,二者相互作用的原理和抗病毒機制還有待于進一步揭示。本研究首次證實ch IFITM1蛋白具有抑制病毒復(fù)制的能力,發(fā)現(xiàn)ch IFITM1蛋白特有的抑制病毒復(fù)制機制。
【關(guān)鍵詞】：雞傳染性支氣管炎病毒 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 新城疫病毒 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 引言16-27
• 1.1 雞傳染性支氣管炎概述16-18
• 1.1.1 雞傳染性支氣管炎病原學(xué)及形態(tài)學(xué)16
• 1.1.2 雞傳染性支氣管炎病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白16-17
• 1.1.3 雞傳染性支氣管炎病毒分子流行病學(xué)17-18
• 1.2 冠狀病毒相關(guān)天然免疫研究進展18-22
• 1.2.1 冠狀病毒概述18-19
• 1.2.2 宿主針對冠狀病毒的天然免疫應(yīng)答19-22
• 1.3 新城疫病毒致病機制研究進展22-24
• 1.3.1 新城疫概述22
• 1.3.2 NDV的生物學(xué)特性22
• 1.3.3 NDV分子致病機制22-24
• 1.4 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的研究進展24-26
• 1.4.1 病毒抑制因子—干擾素誘導(dǎo)蛋白24-25
• 1.4.2 IFITM的發(fā)現(xiàn)25
• 1.4.3 IFITM抗病毒研究進展25-26
• 1.5 本研究的目的和意義26-27
• 第二章 雞傳染性支氣管炎病毒感染雞腎臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.27-47
• 2.1 材料和方法28-30
• 2.1.1 病毒和實驗動物28
• 2.1.2 主要試劑28
• 2.1.3 主要實驗儀器及軟件28
• 2.1.4 動物感染試驗及樣品采集28
• 2.1.5 IBV抗體效價檢測28
• 2.1.6 Real-time RT-PCR檢測腎臟中病毒載量28-29
• 2.1.7 IBV感染雞腎臟組織轉(zhuǎn)錄組分析29
• 2.1.8 數(shù)據(jù)處理29
• 2.1.9 生物信息學(xué)分析29-30
• 2.1.10 熒光定量RT-PCR驗證差異表達基因30
• 2.2 結(jié)果30-44
• 2.2.1 臨床癥狀及血清抗體檢測結(jié)果30
• 2.2.2 腎臟中病毒載量30-31
• 2.2.3 IBV感染致死雞腎臟組織轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果31
• 2.2.4 差異表達基因的生物信息學(xué)分析31-43
• 2.2.5 熒光定量RT-PCR驗證部分差異表達基因43-44
• 2.3 討論44-47
• 2.3.1 模式識別受體的差異表達情況45
• 2.3.2 IBV感染激活干擾素通路45-46
• 2.3.3 IBV感染激發(fā)炎癥反應(yīng)46
• 2.3.4 細胞凋亡參與IBV感染過程46-47
• 第三章 雞傳染性支氣管炎病毒感染雞脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析47-62
• 3.1 材料和方法48-52
• 3.1.1 病毒和實驗動物48
• 3.1.2 主要試劑48
• 3.1.3 主要實驗儀器及軟件48
• 3.1.4 動物感染試驗及樣品采集48-49
• 3.1.5 Real-time RT-PCR檢測氣管中病毒載量49
• 3.1.6 IBV感染雞脾臟組織轉(zhuǎn)錄組分析49
• 3.1.7 數(shù)據(jù)處理49
• 3.1.8 生物信息學(xué)分析49
• 3.1.9 熒光定量RT-PCR驗證差異表達基因49-52
• 3.2 結(jié)果52-59
• 3.2.1 檢測氣管中病毒RNA52
• 3.2.2 IBV感染早期和晚期脾臟組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果52-58
• 3.2.3 差異表達基因的KEGG通路分析58
• 3.2.4 熒光定量RT-PCR驗證部分差異表達基因58-59
• 3.3 討論59-62
• 第四章 雞干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1抑制NDV和IBV復(fù)制的研究62-80
• 4.1 材料和方法63-68
• 4.1.1 病毒、菌株、細胞及質(zhì)粒63
• 4.1.2 SPF雞和雞外周血紅細胞63
• 4.1.3 主要試劑和儀器63
• 4.1.4 IFITM生物信息學(xué)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹63-64
• 4.1.5 檢測chIFITM1 mRNA的體內(nèi)外表達情況64
• 4.1.6 IBV和NDV感染后靶器官中chIFITM1 mRNA的表達情況64
• 4.1.7 過表達chIFITM對NDV和IBV復(fù)制的影響64-66
• 4.1.8 chIFITM1蛋白的亞細胞定位66
• 4.1.9 chIFITM蛋白相互作用研究66-68
• 4.2 結(jié)果68-77
• 4.2.1 chIFITM1的生物信息學(xué)分析68-70
• 4.2.2 chIFITM1體內(nèi)外分布情況70-72
• 4.2.3 chIFITM1抑制NDV和IBV復(fù)制72-74
• 4.2.4 缺失N端和C端對chIFITM1抗病毒活性的影響74
• 4.2.5 chIFITM1和NDV HN蛋白的亞細胞定位情況74-75
• 4.2.6 chIFITM1的原核表達和純化75-76
• 4.2.7 chIFITM1-His蛋白與EIF5A1蛋白的相互作用76-77
• 4.2.8 EIF5A1 抑制 NDV 復(fù)制77
• 4.3 討論77-80
• 第五章 全文結(jié)論80-81
• 參考文獻81-91
• 致謝91-92
• 作者簡歷92

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本文編號：524561