CV-A5小鼠主動免疫保護模型建立及候選疫苗體內(nèi)效力評估
發(fā)布時間:2022-02-19 04:56
手足口。╤and,foot,mouth diseases,HFMD)已成為我國發(fā)病率較高的丙類傳染病。人腸道病毒71型(EV-71)、柯薩奇病毒A組、B組、?刹《揪餒FMD。2008年HFMD在我國爆發(fā)流行,同年被納入傳染病防治法進行管理和檢測。隨著EV-71疫苗的上市,重癥HFMD病例明顯減少。但是自2012年以來我國由非EV-71、非柯薩奇病毒A16型(CV-A16)引起的HFMD爆發(fā)逐漸增多。在北京、山東、廣州、湖南、福州和深圳等省市已超過50%,并且在部分地區(qū)達到了80%以上。根據(jù)2018年中國疾病控制中心(CDC)發(fā)布的HFMD病例數(shù)據(jù)顯示排除EV-71和CV-A16,柯薩奇病毒A6型(CV-A6)和柯薩奇病毒A10型(CV-A10)占比升高,柯薩奇病毒A2型(CV-A2)、柯薩奇病毒A5型(CV-A5)的病例開始增加。而本研究樣品的來源湖北襄陽地區(qū),基于EV-71疫苗干預的背景下,2016-2017年期間HFMD患兒的3216份臨床樣本中分析得知CV-A5的發(fā)病率增高至4.57%。為了降低HFMD的發(fā)病率,在EV-71疫苗基礎上研發(fā)多價HFMD疫苗勢在必行。但CV-...
【文章來源】:武漢生物制品研究所湖北省
【文章頁數(shù)】:123 頁
【學位級別】:碩士
【文章目錄】:
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一章 實驗材料與方法
1 實驗材料
1.1 病毒,細胞
1.2 質(zhì)粒,克隆測序用引物,菌株
1.3 實驗動物
2 實驗試劑
3 常規(guī)實驗試劑的配置方法
3.1 細菌培養(yǎng)相關試劑
3.2 SDS-PAGE及 WB相關試劑
3.3 核酸電泳相關試劑
3.4 IFA實驗試劑
3.5 細胞,病毒培養(yǎng)相關試劑
4 實驗儀器設備
5 實驗方法
5.1 GST-VP1-ΔN56,GST-VP2-ΔN25,GST-VP3-ΔN8 多克隆抗體的制備
5.2 細胞培養(yǎng)
5.3 病毒傳代
5.4 基于RD/Vero細胞基質(zhì)的相關病毒滴定
5.5 CV-A5在昆明鼠體內(nèi)適應性傳代
5.6 基于Vero細胞基質(zhì)CV-A5 疫苗候選株的篩選,構建,拯救及免疫原性研究
5.7 CV-A5疫苗候選株生物學特性和免疫原性研究
5.8 CV-A5主動免疫保護模型的建立
第二章 CV-A5-VP1、VP2、VP3、FP兔多克隆抗體的制備及應用
1 結果
1.1 構建pGEX-6p-1-VP1-ΔN56、pGEX-6p-1-VP2-ΔN119、pGEX-6p-1-VP3-ΔN8重組質(zhì)粒
1.2 GST-VP1-ΔN56、GST-VP2-ΔN119、GST-VP3-ΔN8 重組融合蛋白可溶性分析
1.3 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗體效價測定
1.4 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗體的特異性分析
1.5 多克隆抗體免疫熒光鑒定
2 小結
第三章 CV-A5在小鼠體內(nèi)進行適應性傳代
1 結果
1.1 CV-A5-M14的篩選過程
1.2 CV-A5-M14感染14日齡昆明鼠最優(yōu)的感染途徑選擇
1.3 CV-A5-M14 對昆明鼠和Balb/C鼠敏感性比較
1.4 CV-A5-M14 LD_(50) 測定
1.5 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 兩克隆株毒力比較
1.6 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 全基因組序列分析
2 小結
第四章 CV-A5 疫苗候選株篩選,感染性c DNA的構建及病毒拯救
1 結果
1.1 PBR322-CV-A5-rN4,PBR322-CV-A5-rN20 重組質(zhì)粒構建及線性化
1.2 體外轉(zhuǎn)錄vRNA
1.3 病毒轉(zhuǎn)染Vero細胞,及連續(xù)傳代
1.4 CV-A5-N4-P3,CV-A5-N20-P3 病毒原毒株,拯救株病毒滴度比較
1.5 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 疫苗候選株生長曲線分析
1.6 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 全序列比較
2 小結
第五章 CV-A5 Vero細胞基質(zhì)抗原純化及免疫原性研究
1 實驗結果
1.1 CsCl梯度離心純化CV-A5 病毒顆粒
1.2 TEM,SDS-PAGE,WB鑒定病毒顆粒
1.3 CV-A5 抗原產(chǎn)量比較及EP、FP、DP比例計算
1.4 中和毒的滴度測定
1.5 中和毒的鑒定
1.6 CV-A5免疫原性實驗
1.7 CV-A5-3487 株免疫血清與CV-A5 Swartz株,EV-71 的交叉中和反應
2 小結
第六章 主動免疫保護實驗
1 結果
1.1 14日齡昆明鼠主動免疫保護實驗存活率、臨床評分和體重變化
1.2 RNA標準品制備
1.3 病毒載量的測定
1.4 主動免疫保護模型小鼠中和血清效價測定
1.5 組織病理切片分析
1.6 免疫組化切片分析
2 小結
第七章 總結,討論與后續(xù)實驗計劃
1 總結和討論
2 研究意義
3 下一步的工作計劃
參考文獻
附錄
在讀期間論文發(fā)表情況
致謝
【參考文獻】:
期刊論文
[1]深圳市龍華區(qū)皰疹性咽峽炎病原學特點[J]. 許少堅,郝夏瓊,任燕,姚相杰,陳龍,全德甫,賴曉玲,滿云翔,劉佳嫻,曹赫,林啟輝. 中國熱帶醫(yī)學. 2019(03)
[2]2014—2016年孝感地區(qū)手足口病流行病學及柯薩奇病毒A6和A5型基因特征[J]. 丁穗,李從榮,王遠虹,駱勝超,喻珂,張平. 職業(yè)與健康. 2018(08)
[3]柯薩奇病毒A組天津分離株的分型鑒定及分子特征分析[J]. 楊東靖,李力,呂莉琨,李佳萌,譚昭麟,蘇旭. 國際病毒學雜志. 2016 (04)
[4]Monoclonal neutralizing antibodies against EV71 screened from mice immunized with yeast-produced virus-like particles[J]. Tao Lin,Lingzhi Xianyu,Songya Lyu. Virologica Sinica. 2015(03)
[5]2008~2009年青島地區(qū)手足口病病原學的調(diào)查分析[J]. 汪照國,劉曉琳,楊婷婷,弋英. 病毒學報. 2011(05)
[6]2008年廣州地區(qū)手足口病的病原學研究[J]. 朱冰,鐘家禹,夏慧敏,龔四堂,肖密絲,謝嘉慧,張瑩瑩,華亮,連廣琬. 中華兒科雜志. 2010 (02)
[7]從我國成人手足口病患者皰液中首次分離出腸道病毒71型[J]. 鄭志明,張江虹,諸衛(wèi)平,何佩君. 病毒學雜志. 1989(04)
本文編號:3632260
【文章來源】:武漢生物制品研究所湖北省
【文章頁數(shù)】:123 頁
【學位級別】:碩士
【文章目錄】:
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一章 實驗材料與方法
1 實驗材料
1.1 病毒,細胞
1.2 質(zhì)粒,克隆測序用引物,菌株
1.3 實驗動物
2 實驗試劑
3 常規(guī)實驗試劑的配置方法
3.1 細菌培養(yǎng)相關試劑
3.2 SDS-PAGE及 WB相關試劑
3.3 核酸電泳相關試劑
3.4 IFA實驗試劑
3.5 細胞,病毒培養(yǎng)相關試劑
4 實驗儀器設備
5 實驗方法
5.1 GST-VP1-ΔN56,GST-VP2-ΔN25,GST-VP3-ΔN8 多克隆抗體的制備
5.2 細胞培養(yǎng)
5.3 病毒傳代
5.4 基于RD/Vero細胞基質(zhì)的相關病毒滴定
5.5 CV-A5在昆明鼠體內(nèi)適應性傳代
5.6 基于Vero細胞基質(zhì)CV-A5 疫苗候選株的篩選,構建,拯救及免疫原性研究
5.7 CV-A5疫苗候選株生物學特性和免疫原性研究
5.8 CV-A5主動免疫保護模型的建立
第二章 CV-A5-VP1、VP2、VP3、FP兔多克隆抗體的制備及應用
1 結果
1.1 構建pGEX-6p-1-VP1-ΔN56、pGEX-6p-1-VP2-ΔN119、pGEX-6p-1-VP3-ΔN8重組質(zhì)粒
1.2 GST-VP1-ΔN56、GST-VP2-ΔN119、GST-VP3-ΔN8 重組融合蛋白可溶性分析
1.3 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗體效價測定
1.4 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗體的特異性分析
1.5 多克隆抗體免疫熒光鑒定
2 小結
第三章 CV-A5在小鼠體內(nèi)進行適應性傳代
1 結果
1.1 CV-A5-M14的篩選過程
1.2 CV-A5-M14感染14日齡昆明鼠最優(yōu)的感染途徑選擇
1.3 CV-A5-M14 對昆明鼠和Balb/C鼠敏感性比較
1.4 CV-A5-M14 LD_(50) 測定
1.5 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 兩克隆株毒力比較
1.6 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 全基因組序列分析
2 小結
第四章 CV-A5 疫苗候選株篩選,感染性c DNA的構建及病毒拯救
1 結果
1.1 PBR322-CV-A5-rN4,PBR322-CV-A5-rN20 重組質(zhì)粒構建及線性化
1.2 體外轉(zhuǎn)錄vRNA
1.3 病毒轉(zhuǎn)染Vero細胞,及連續(xù)傳代
1.4 CV-A5-N4-P3,CV-A5-N20-P3 病毒原毒株,拯救株病毒滴度比較
1.5 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 疫苗候選株生長曲線分析
1.6 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 全序列比較
2 小結
第五章 CV-A5 Vero細胞基質(zhì)抗原純化及免疫原性研究
1 實驗結果
1.1 CsCl梯度離心純化CV-A5 病毒顆粒
1.2 TEM,SDS-PAGE,WB鑒定病毒顆粒
1.3 CV-A5 抗原產(chǎn)量比較及EP、FP、DP比例計算
1.4 中和毒的滴度測定
1.5 中和毒的鑒定
1.6 CV-A5免疫原性實驗
1.7 CV-A5-3487 株免疫血清與CV-A5 Swartz株,EV-71 的交叉中和反應
2 小結
第六章 主動免疫保護實驗
1 結果
1.1 14日齡昆明鼠主動免疫保護實驗存活率、臨床評分和體重變化
1.2 RNA標準品制備
1.3 病毒載量的測定
1.4 主動免疫保護模型小鼠中和血清效價測定
1.5 組織病理切片分析
1.6 免疫組化切片分析
2 小結
第七章 總結,討論與后續(xù)實驗計劃
1 總結和討論
2 研究意義
3 下一步的工作計劃
參考文獻
附錄
在讀期間論文發(fā)表情況
致謝
【參考文獻】:
期刊論文
[1]深圳市龍華區(qū)皰疹性咽峽炎病原學特點[J]. 許少堅,郝夏瓊,任燕,姚相杰,陳龍,全德甫,賴曉玲,滿云翔,劉佳嫻,曹赫,林啟輝. 中國熱帶醫(yī)學. 2019(03)
[2]2014—2016年孝感地區(qū)手足口病流行病學及柯薩奇病毒A6和A5型基因特征[J]. 丁穗,李從榮,王遠虹,駱勝超,喻珂,張平. 職業(yè)與健康. 2018(08)
[3]柯薩奇病毒A組天津分離株的分型鑒定及分子特征分析[J]. 楊東靖,李力,呂莉琨,李佳萌,譚昭麟,蘇旭. 國際病毒學雜志. 2016 (04)
[4]Monoclonal neutralizing antibodies against EV71 screened from mice immunized with yeast-produced virus-like particles[J]. Tao Lin,Lingzhi Xianyu,Songya Lyu. Virologica Sinica. 2015(03)
[5]2008~2009年青島地區(qū)手足口病病原學的調(diào)查分析[J]. 汪照國,劉曉琳,楊婷婷,弋英. 病毒學報. 2011(05)
[6]2008年廣州地區(qū)手足口病的病原學研究[J]. 朱冰,鐘家禹,夏慧敏,龔四堂,肖密絲,謝嘉慧,張瑩瑩,華亮,連廣琬. 中華兒科雜志. 2010 (02)
[7]從我國成人手足口病患者皰液中首次分離出腸道病毒71型[J]. 鄭志明,張江虹,諸衛(wèi)平,何佩君. 病毒學雜志. 1989(04)
本文編號:3632260
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