本文關鍵詞：NGAL噬菌體單鏈抗體的篩選、表達及其在免疫膠體金檢測方法中的初步應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程密切相關,是新的早期腎損傷生化標志物。本研究旨在應用噬菌體展示技術篩選NGAL特異性抗體,并建立免疫膠體金檢測技術,為體內(nèi)NGAL變化水平的檢測提供方法,為急性腎損傷的診斷提供幫助。本論文采用免疫的Balb/C小鼠,從其脾臟中提取總RNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,通過設計的簡并引物來擴增輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH),經(jīng)過重疊延伸PCR方法連接為單鏈抗體基因(scFv)。經(jīng)sfiI、Xbal雙酶切后連接到噬菌體載體pCantab5E中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl成功構建了庫容為5×107pfu的鼠源噬菌體抗體庫。經(jīng)過PCR檢測,抗體庫的插入率為85%。隨機挑取部分單克隆測序分析發(fā)現(xiàn)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列均不相同,說明了本研究構建的鼠源噬菌體抗體庫多樣性較好。以重組蛋白NGAL作為靶蛋白對噬菌體抗體庫進行了四輪富集,從第四輪篩選后的抗性平板上挑取了30個單克隆進行了噬菌體抗體ELISA鑒定,將陽性克隆構建CHO細胞表達載體,轉(zhuǎn)染到CHO細胞中并進行壓力篩選、重組表達,對表達純化后的抗體進行了SDS-PAGE、ELISA效價及親和力分析。結果表明,單克隆有11個為強陽性。ELISA測定抗體效價為1:107,抗體親和力為6.532×10-9M。表明本論文成功獲得了NGAL基因工程抗體,為NGAL檢測診斷方法的建立提供了物質(zhì)基礎。應用重組表達的抗體與實驗室制備的多抗,建立了NGAL免疫膠體金檢測方法。確定了免疫膠體金層析方法最優(yōu)條件：金標抗體標記量12μg/mL,金標抗體的穩(wěn)定劑為0.08%的PEG-20000,金標抗體的保存液為20 mM pH 8.2硼酸緩沖液(含0.01%Na2N3、0.08% PEG-20000);結合墊處理液為20 mM pH 9.0 Tris-HCl(含0.5% PVP-40、0.5% Trion)、樣品墊處理液為0.01 mol/L pH 7.4 TBS(含1% BSA、0.05% Tween20)、金標抗體噴涂量為0.5μL/mL、羊抗NGAL抗體噴涂量為1.2μL/mL、羊抗人的IgG噴涂量為4μL/mL。將試紙條分別置于37℃及4℃密封干燥避光保存,到第20周其敏感性和特異性均沒有降低。使用該試紙條對40份臨床樣本進行了檢測,結果與臨床檢測結果完全一致。上述結果表明,本論文建立的免疫膠體金檢測方法的穩(wěn)定性、特異性較高,在臨床樣品檢測上有較高的價值。
【關鍵詞】：噬菌體抗體庫 NGAL 篩選 真核表達 免疫膠體金
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-21
• 1.1 NGAL簡介10-12
• 1.2 基因工程抗體簡介12-15
• 1.2.1 基因工作抗體的種類12-13
• 1.2.2 基因工程抗體的表達系統(tǒng)13-15
• 1.3 噬菌體抗體庫技術及其應用的研究進展15-18
• 1.3.1 噬茵體抗體庫技術的優(yōu)點15
• 1.3.2 噬菌體抗體的分類15-16
• 1.3.3 目標抗體的篩選與表達16-17
• 1.3.4 噬菌體抗體庫技術應用的研究進展17-18
• 1.4 免疫膠體金技術概述18-19
• 1.4.1 免疫膠體金技術的基本原理18-19
• 1.4.2 免疫膠體金技術的優(yōu)點19
• 1.5 本研究的目的和意義19-21
• 第二章 NGAL噬菌體抗體庫的構建21-31
• 2.1 引言21
• 2.2 試劑與儀器21-22
• 2.2.1 實驗試劑及材料21-22
• 2.2.2 實驗儀器22
• 2.3 試驗方法22-26
• 2.3.1 BALB/c鼠免疫22
• 2.3.2 小鼠脾臟總RNA提取22
• 2.3.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA22
• 2.3.4 PCR擴增小鼠抗體輕鏈、重鏈基因22-24
• 2.3.5 ScFv的PCR擴增24
• 2.3.6 ScFv基因與載體pCantab5E酶切24
• 2.3.7 抗體基因ScFv與載體pCantab5E連接24-25
• 2.3.8 連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化25
• 2.3.9 噬菌體抗體庫重組率鑒定和多樣性分析25-26
• 2.4 試驗結果26-29
• 2.4.1 NGAL蛋白免疫小鼠血清效價測定26
• 2.4.2 小鼠脾臟RNA提取26
• 2.4.3 小鼠抗體VH和VL PCR擴增26-27
• 2.4.4 ScFv基因PCR拼接27
• 2.4.5 NGAL小鼠噬菌體抗體庫庫容27-28
• 2.4.6 噬菌體抗體庫的插入率及多樣性分析28-29
• 2.5 本章小結29-31
• 第三章 NGAL噬菌體抗體庫的篩選及抗體表達31-42
• 3.1 引言31
• 3.2 試劑與儀器31-32
• 3.2.1 實驗試劑及材料31-32
• 3.2.2 實驗儀器32
• 3.3 試驗方法32-37
• 3.3.1 噬菌體表面展示抗體庫的制備32
• 3.3.2 NGAL噬菌體抗體庫的篩選32-33
• 3.3.3 ELISA鑒定重組噬菌體單克隆33
• 3.3.4 陽性克隆序列分析33
• 3.3.5 重組抗體真核表達載體構建33-34
• 3.3.6 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細胞34
• 3.3.7 雙抗夾心ELISA方法檢測重組抗體的表達34-35
• 3.3.8 重組抗體的純化35
• 3.3.9 純化抗體的SDS-PAGE鑒定35-36
• 3.3.10 ELISA鑒定純化后抗體活性36
• 3.3.11 親和力測定36-37
• 3.4 試驗結果37-40
• 3.4.1 NGAL噬菌體抗體庫的富集37
• 3.4.2 噬菌體單克隆鑒定37-38
• 3.4.3 噬菌體抗體基因序列38
• 3.4.4 抗體基因表達載體構建38-39
• 3.4.5 ELISA鑒定細胞表達上清39
• 3.4.6 純化抗體SDS-PAGE鑒定39
• 3.4.7 純化抗體的活性鑒定39-40
• 3.4.8 純化抗體的活性鑒定40
• 3.5 本章小結40-42
• 第四章 NGAL基因工程抗體在免疫膠體金檢測方法中的應用42-52
• 4.1 引言42
• 4.2 試劑與儀器42-43
• 4.2.1 實驗試劑及材料42
• 4.2.2 實驗儀器42-43
• 4.3 試驗方法43-46
• 4.3.1 金標抗體的制備與純化43
• 4.3.2 結合墊、樣品墊的預處理43
• 4.3.3 金墊的制備及抗體噴涂43
• 4.3.4 免疫膠體金測試條的組裝43-44
• 4.3.5 免疫膠體金層析法各種最佳條件的選擇44-46
• 4.3.6 測試方法與評判46
• 4.3.7 特異性試驗46
• 4.3.8 穩(wěn)定性試驗46
• 4.3.9 對臨床樣品的檢測46
• 4.4 試驗結果46-50
• 4.4.1 免疫膠體金層析法各種最佳條件的選擇46-49
• 4.4.2 特異性試驗49
• 4.4.3 穩(wěn)定性試驗49-50
• 4.4.4 對臨床樣品的檢測50
• 4.5 本章小結50-52
• 第五章 總結和展望52-53
• 5.1 總結52
• 5.2 展望52-53
• 參考文獻53-60
• 碩士期間發(fā)表論文60-61
• 致謝61

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