目的:異體造血干細胞移植被廣泛用于治療血液類疾�。ㄈ绨籽�,貧血癥等）,用來實現(xiàn)長期的多譜系造血重建。但是,異體來源的造血干細胞細胞來源問題限制了造血干細胞移植的臨床應(yīng)用。臍帶血作為異體造血干細胞的細胞來源之一,具有很多優(yōu)點,例如相對容易獲得較低的免疫源性,即使在HLA配型不一致的情況下,也很少發(fā)生GVHD現(xiàn)象。但是每份臍帶血中所含的HSCs數(shù)量少,不足以移植一個個體,這個缺點極大限制了其作為造血干細胞移植的供體細胞。多能造血祖細胞（MPPs）作為造血干細胞的直接衍生細胞,可以分化產(chǎn)生所有譜系的成熟血液細胞。探索延長多能造血祖細胞和譜系特化祖細胞造血生成的時長可以作為實現(xiàn)長期多譜系造血生成的新思路。前期研究表明,Nup98-Hoxa10hd（NA）融合蛋白可以擴增造血干細胞和賦予其移植競爭優(yōu)勢且不引發(fā)腫瘤。在本研究中我們想探究NA基因?qū)PPs和下游的譜系特化祖細胞的影響。方法:通過小鼠基因型鑒定實驗,鑒定NA^LSL/+;Vav-Cre復(fù)合型小鼠（NA小鼠）;通過抗體染色和流式分選實驗,分選獲得多能造血祖細胞（MPPs）,用于移植實驗;通過移植實驗及受體鼠外周血動... 

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

NALSL/+品系小鼠構(gòu)建策略將含元件LSL-Nup98-Hoxa9hd-IRES-Tdtomato的載體通過基因打靶重組到小鼠基因組

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文26鼠可通過Tdtomato標記基因經(jīng)流式分析鑒定（圖3.2B）。圖3.2NA小鼠基因型鑒定（A）NALSL/+品系小鼠鑒定，目的序列為350bp，純合子小鼠。圖中381#、382#、383#小鼠為所需小鼠。再與Vav-Cre小鼠交配產(chǎn)生NALSL/+；Vav-Cre復(fù)合型小鼠。（B）NA小鼠流式鑒定的結(jié)果。由于在目的序列后插入了報告基因Tdtomato，故在于Vav-Cre小鼠交配后產(chǎn)生的復(fù)合小鼠，通過Cre重組酶切掉了Loxp位點間的序列開啟了目的基因的表達，所以通過Tdtomato基因是否表達來鑒定小鼠。注：NALSL/+小鼠由百奧賽圖公司構(gòu)建。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓HSC中過表達NA，可以在競爭移植中賦予其移植競爭力[55]。為了檢測NAMPPs是否能夠支持體內(nèi)長期多譜系造血生成，我們直接取NA小鼠的骨髓細胞進行染色。實驗組分選了300個NAMPPs，混合5x105個骨髓細胞（WT，CD45.2），經(jīng)眼靜脈移植到致死劑量輻照受體小鼠體內(nèi)（圖3.3）。同時分選正常小鼠（WT，CD45.1）的MPPs混合5x105個骨髓細胞（WT，CD45.2）做為對照組。在后續(xù)的流式分析實驗中，Tdtomato+細胞為NAMPPs供體來源的衍生細胞，CD45.1+細胞為WTMPPs供體來源的衍生細胞。

結(jié)果27圖3.3小鼠移植策略圖多能造血祖細胞（MPPs）移植實驗。取NALSL/+；Vav-Cre復(fù)合型小鼠（CD45.2+，Tdtomato+）和正常小鼠（CD45.1+）的骨髓，直接分選，每個樣品分選300個MPPs細胞（Lin-CD48-ckit+Sca1+CD135+CD150-），同時混合5×105個骨髓細胞（CD45.2+，helpercells）進行小鼠眼靜脈移植。在移植前，小鼠接受致死劑量輻照（照兩次4.75Gy，間隔4h）。（該實驗與董勇共同完成）受體小鼠移植后，每個月通過眼球靜脈采血方式獲取外周血檢測供體細胞比率及供體來源細胞譜系比例。移植后流式分析結(jié)果顯示，移植的300個NAMPPs可以在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)造血重建，長期維持多譜系造血生成，至實驗結(jié)束時共44周。在第四周時間點，經(jīng)流式分析顯示，NAMPPs實驗組供體細胞的起始貢獻率是41%；從16周到36周，流式分析結(jié)果顯示，供體細胞的貢獻率上升，維持在60%左右；到第44周，供體細胞貢獻率下降到44%；而WTMPPs對照組在第四周檢測時的貢獻率為35%左右，隨后時間點的流式檢測，供體細胞的貢獻率持續(xù)下降，直至第20周，供體細胞的貢獻率為0（圖3.4A）。我們進一步分析了供體來源細胞的譜系。NAMPPs細胞主要分化為髓系細胞、T細胞和B細胞，分化的B細胞居多（圖3.4B；圖3.5）。同時，在原代受體鼠中可以觀察到非NA供體細胞來源的多譜系血液細胞（圖3.6）。綜上所述，我們證明了在helper細胞來源及受體鼠來源的HSC競爭的情況下，過表達NA的MPPs移植入原代受體鼠中，可以支持長期多譜系造血生成。


本文編號：3330298