發(fā)布時(shí)間：2021-08-08 16:32

　　目的:異體造血干細(xì)胞移植被廣泛用于治療血液類疾�。ㄈ绨籽�,貧血癥等）,用來實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的多譜系造血重建。但是,異體來源的造血干細(xì)胞細(xì)胞來源問題限制了造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。臍帶血作為異體造血干細(xì)胞的細(xì)胞來源之一,具有很多優(yōu)點(diǎn),例如相對(duì)容易獲得較低的免疫源性,即使在HLA配型不一致的情況下,也很少發(fā)生GVHD現(xiàn)象。但是每份臍帶血中所含的HSCs數(shù)量少,不足以移植一個(gè)個(gè)體,這個(gè)缺點(diǎn)極大限制了其作為造血干細(xì)胞移植的供體細(xì)胞。多能造血祖細(xì)胞（MPPs）作為造血干細(xì)胞的直接衍生細(xì)胞,可以分化產(chǎn)生所有譜系的成熟血液細(xì)胞。探索延長(zhǎng)多能造血祖細(xì)胞和譜系特化祖細(xì)胞造血生成的時(shí)長(zhǎng)可以作為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期多譜系造血生成的新思路。前期研究表明,Nup98-Hoxa10hd（NA）融合蛋白可以擴(kuò)增造血干細(xì)胞和賦予其移植競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)且不引發(fā)腫瘤。在本研究中我們想探究NA基因?qū)PPs和下游的譜系特化祖細(xì)胞的影響。方法:通過小鼠基因型鑒定實(shí)驗(yàn),鑒定NA^LSL/+;Vav-Cre復(fù)合型小鼠（NA小鼠）;通過抗體染色和流式分選實(shí)驗(yàn),分選獲得多能造血祖細(xì)胞（MPPs）,用于移植實(shí)驗(yàn);通過移植實(shí)驗(yàn)及受體鼠外周血?jiǎng)?.. 

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

NALSL/+品系小鼠構(gòu)建策略將含元件LSL-Nup98-Hoxa9hd-IRES-Tdtomato的載體通過基因打靶重組到小鼠基因組

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文26鼠可通過Tdtomato標(biāo)記基因經(jīng)流式分析鑒定（圖3.2B）。圖3.2NA小鼠基因型鑒定（A）NALSL/+品系小鼠鑒定，目的序列為350bp，純合子小鼠。圖中381#、382#、383#小鼠為所需小鼠。再與Vav-Cre小鼠交配產(chǎn)生NALSL/+；Vav-Cre復(fù)合型小鼠。（B）NA小鼠流式鑒定的結(jié)果。由于在目的序列后插入了報(bào)告基因Tdtomato，故在于Vav-Cre小鼠交配后產(chǎn)生的復(fù)合小鼠，通過Cre重組酶切掉了Loxp位點(diǎn)間的序列開啟了目的基因的表達(dá)，所以通過Tdtomato基因是否表達(dá)來鑒定小鼠。注：NALSL/+小鼠由百奧賽圖公司構(gòu)建。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓HSC中過表達(dá)NA，可以在競(jìng)爭(zhēng)移植中賦予其移植競(jìng)爭(zhēng)力[55]。為了檢測(cè)NAMPPs是否能夠支持體內(nèi)長(zhǎng)期多譜系造血生成，我們直接取NA小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)組分選了300個(gè)NAMPPs，混合5x105個(gè)骨髓細(xì)胞（WT，CD45.2），經(jīng)眼靜脈移植到致死劑量輻照受體小鼠體內(nèi)（圖3.3）。同時(shí)分選正常小鼠（WT，CD45.1）的MPPs混合5x105個(gè)骨髓細(xì)胞（WT，CD45.2）做為對(duì)照組。在后續(xù)的流式分析實(shí)驗(yàn)中，Tdtomato+細(xì)胞為NAMPPs供體來源的衍生細(xì)胞，CD45.1+細(xì)胞為WTMPPs供體來源的衍生細(xì)胞。

結(jié)果27圖3.3小鼠移植策略圖多能造血祖細(xì)胞（MPPs）移植實(shí)驗(yàn)。取NALSL/+；Vav-Cre復(fù)合型小鼠（CD45.2+，Tdtomato+）和正常小鼠（CD45.1+）的骨髓，直接分選，每個(gè)樣品分選300個(gè)MPPs細(xì)胞（Lin-CD48-ckit+Sca1+CD135+CD150-），同時(shí)混合5×105個(gè)骨髓細(xì)胞（CD45.2+，helpercells）進(jìn)行小鼠眼靜脈移植。在移植前，小鼠接受致死劑量輻照（照兩次4.75Gy，間隔4h）。（該實(shí)驗(yàn)與董勇共同完成）受體小鼠移植后，每個(gè)月通過眼球靜脈采血方式獲取外周血檢測(cè)供體細(xì)胞比率及供體來源細(xì)胞譜系比例。移植后流式分析結(jié)果顯示，移植的300個(gè)NAMPPs可以在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)造血重建，長(zhǎng)期維持多譜系造血生成，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)共44周。在第四周時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)流式分析顯示，NAMPPs實(shí)驗(yàn)組供體細(xì)胞的起始貢獻(xiàn)率是41%；從16周到36周，流式分析結(jié)果顯示，供體細(xì)胞的貢獻(xiàn)率上升，維持在60%左右；到第44周，供體細(xì)胞貢獻(xiàn)率下降到44%；而WTMPPs對(duì)照組在第四周檢測(cè)時(shí)的貢獻(xiàn)率為35%左右，隨后時(shí)間點(diǎn)的流式檢測(cè)，供體細(xì)胞的貢獻(xiàn)率持續(xù)下降，直至第20周，供體細(xì)胞的貢獻(xiàn)率為0（圖3.4A）。我們進(jìn)一步分析了供體來源細(xì)胞的譜系。NAMPPs細(xì)胞主要分化為髓系細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞，分化的B細(xì)胞居多（圖3.4B；圖3.5）。同時(shí)，在原代受體鼠中可以觀察到非NA供體細(xì)胞來源的多譜系血液細(xì)胞（圖3.6）。綜上所述，我們證明了在helper細(xì)胞來源及受體鼠來源的HSC競(jìng)爭(zhēng)的情況下，過表達(dá)NA的MPPs移植入原代受體鼠中，可以支持長(zhǎng)期多譜系造血生成。


本文編號(hào)：3330298