目的:構(gòu)建pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體在MDS細(xì)胞株中靶向抑制精子相關(guān)抗原6（sperm-associated antigen 6,SPAG6）基因的表達(dá),探索SPAG6基因沉默對SKM-1細(xì)胞自噬的影響及可能的分子機(jī)制,并初步探討在SKM-1細(xì)胞中細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。方法:1.篩選慢病毒靶向沉默SPAG6基因表達(dá)的最佳序列并構(gòu)建SPAG6-/-型穩(wěn)定感染的SKM-1細(xì)胞株模型:體外培養(yǎng)SKM-1細(xì)胞分別感染陰性對照慢病毒載體（NC-shRNA）和靶向抑制SPAG6基因表達(dá)慢病毒載體（SPAG6-shRNA）,熒光倒置顯微鏡觀察SKM-1細(xì)胞綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況,0.5μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的SKM-1細(xì)胞株2周,并用流式細(xì)胞儀檢測慢病毒感染效率;qRT-PCR和Western blot法驗(yàn)證SPAG6基因的干擾效果。2.探索SPAG6基因沉默對SKM-1細(xì)胞自噬和凋亡的影響:qRT-PCR檢測NC-shRNA和SPAG6-shRNA兩組細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平;透射電子顯微鏡（TEM）檢測自噬小體的表達(dá)情況;Western bl... 

【文章來源】： 張夢 重慶醫(yī)科大學(xué)

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

SPAG6-/-型穩(wěn)定感染的SKM-1細(xì)胞株模型成功構(gòu)建Figure1．TheSPAG6-/-infectedSKM-1celllinewassuccessfullyestablished.SKM-1cellsweretransfectedwithGFP-taggedlentiviruswithshRNAtargetingSPAG6and

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文26圖2.SPAG6基因沉默誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞發(fā)生自噬Figure2.SPAG6silencinginducesautophagyinSKM-1cells.(A)RelativemRNAexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingqRTPCR.(B)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,p62,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingwesternblot-analysis.GAPDHwasusedasaloadingcontrol.(C)Transmissionelectronmicroscopyrevealedtheintracellularultrastructuresineachgroup(magnification,x20,000).Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.Redarrowsindicateautophagicvacuoles.Scalebar,1μm.(D)Numberofautophagosomesperfieldwasquantified.Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.*P<0.05;**P<0.01vs.NCshRNA.2.3SPAG6基因沉默誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞發(fā)生凋亡為了研究SPAG6基因?qū)KM-1細(xì)胞凋亡的影響，首先采用Westernblot檢測兩組細(xì)胞中凋亡相關(guān)的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與NC-shRNA組相比，SPAG6-shRNA組Bax和cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)水平降低（圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SPAG6與SKM-1細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)SPAG6-shRNA組細(xì)胞凋亡率高于NC-shRNA組（圖3B和3C）。以上結(jié)果表明，SPAG6基因沉默可誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，SPAG6基因作為癌基因參與MDS的發(fā)病，與課題組既往研究結(jié)果相一致[17-19]。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文27圖3.SPAG6基因沉默誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞發(fā)生凋亡Figure3.SPAG6downregulationtriggersapoptosisinSKM-1cells.(A)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,Bcl-2,Baxandcleavedcaspase-3ineachgroupweredetectedusingwesternblotanalysis.(B)AfterannexinVAPC/DAPIdouble-staining,thetotalapoptosisrateofSKM1cellstreatedwithNC-shRNAorSPAG6-shRNAwasdetectedbyflowcytometry.Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.(C)Analysisoftheapoptoticrateshownin(B).Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.**P<0.01vs.NC-shRNA.2.4抑制自噬可減弱SPAG6基因沉默誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞凋亡自噬和凋亡均是細(xì)胞程序性死亡的方式，兩者之間緊密聯(lián)系，共同調(diào)控細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤中，激活自噬可增加腫瘤細(xì)胞的凋亡[23-24]。為了探討SPAG6基因沉默誘導(dǎo)的自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA


本文編號：3116115