目的:目前研究表明,MPN在臨床上最常見的突變有三種,即JAK2、MPL、CALR,被稱為“驅(qū)動基因”。前期我們課題組研究發(fā)現(xiàn),JAK2V617F患者的體內(nèi)的中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶（NAP）升高,而MPL、CALR患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶（NAP）降低,但其調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究通過將TMT標(biāo)記、高效液相色譜分級技術(shù)、磷酸化肽段的富集技術(shù)以及基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等一系列蛋白組學(xué)分析,對NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR type1和NB4-MSCV細(xì)胞系的全蛋白使用TMT標(biāo)記后,對磷酸化修飾定量組學(xué)進(jìn)行分析,對比磷酸化差異蛋白在突變基因細(xì)胞系與空載對照細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況,比較分析各突變導(dǎo)致NAP不同改變的可能關(guān)鍵通路調(diào)控分子。方法:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)JAK2V617F、MPLW515L、CALR type1突變基因以及空載體對照組基因NB4細(xì)胞模型后,本研究通過蛋白提取、胰酶酶解、TMT標(biāo)記、高效液相色譜（HPLC）分級、親和富集、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析、數(shù)據(jù)庫搜索、生物信息學(xué)分析方法,對樣本中的磷酸化定量組學(xué)進(jìn)行差異分析。結(jié)果:本研究通過蛋... 

【文章來源】： 趙曉雪 山西醫(yī)科大學(xué)

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP慢病毒表達(dá)載體的質(zhì)粒模式圖

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文23JAK2V617FMPLW515LCALRtype1圖2-2各突變基因慢病毒載體測序結(jié)果2.2各突變基因NB4細(xì)胞模型的鑒定將已經(jīng)測序鑒定無誤后的JAK2V617F、MPLW515L、CALRType1、MSCV空載體分別與慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T，培養(yǎng)48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)量，各組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)。收集慢病毒懸液并感染NB4細(xì)胞株,培養(yǎng)72h后,收取適量細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，得到各組NB4細(xì)胞株感染率（GFP陽性率）依次為MSCV（96.2%），JAK2V617F(99.4%),MPLW515L(99.1%),CALRtype1（98.4%），流式檢測結(jié)果圖2-3：Type1:del52bp

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文24圖2-3各突變基因慢病毒載體構(gòu)建NB4細(xì)胞模型流式檢測GFP表達(dá)量2.3對NB4-JAK2V617F（簡稱NB4-JAK2V617F），NB4-MPLW515L（簡稱NB4-MPLW515L）,NB4-CALRtype1（簡稱NB4-CALRtype1）以及NB4-MSCV四種人細(xì)胞系（3次生物學(xué)重復(fù)）全蛋白TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究和生物信息學(xué)分析2.3.1質(zhì)譜質(zhì)控檢測(1)所有鑒定到肽段的長度分布如圖2-4所示，大多數(shù)肽段分布在7-20個(gè)氨基酸中，這符合基于胰蛋白酶消化和HCD片段化的一般規(guī)則。由于碎片離子太少，<5個(gè)氨基酸的肽段，不能產(chǎn)生有效的序列鑒定。>20個(gè)氨基酸肽由于質(zhì)量和電荷數(shù)高，不適合HCD片段JAK2V617FMSCVMPLW515LCALRtype1


本文編號：2950866