目的:神經(jīng)元的極化和生長伴隨著諸多力學(xué)活動。神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor,NGF）能有效促進(jìn)神經(jīng)突起的生長。但是NGF如何通過調(diào)控胞內(nèi)力學(xué)活動參與神經(jīng)元極化和軸突生長少見報道。本課題采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）原理,構(gòu)建了角度結(jié)構(gòu)張力檢測探針,量化細(xì)胞內(nèi)骨架牽拉力,結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白膠體和離子滲透壓的定量檢測,以期揭示神經(jīng)細(xì)胞分化過程中,細(xì)胞骨架牽拉力以及胞內(nèi)滲透壓力對神經(jīng)元極化及軸突生長的力學(xué)作用及其相關(guān)調(diào)控機制,繼而闡明中藥黃芪多糖通過調(diào)控胞內(nèi)張力變化,改善神經(jīng)元突起和軸突生長的藥理機制。方法:NGF刺激神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞,構(gòu)建神經(jīng)突起生長模型;并轉(zhuǎn)染actin、tubulin、vimentin和GFAP四種細(xì)胞骨架熒光張力探針（AcpA、TcpT、VcpV、GcpG）,通過FRET技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)骨架牽拉張力的變化轉(zhuǎn)換為光學(xué)信號,測定不同刺激下細(xì)胞內(nèi)多種骨架蛋白張力的變化趨勢;采用冰點滲透壓儀測定細(xì)胞質(zhì)總滲透壓,研究胞內(nèi)滲透壓對細(xì)胞極化的影響;激光粒度分析儀檢測細(xì)胞質(zhì)蛋白納米顆粒的... 

【文章來源】：南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１：探針的構(gòu)建??

ＮｎｒＨｒ??■”？一？》？？，??ｂ＾Ｈｂ＾Ｕ?．?ｉ?ｉｎ?ｉｌ?，ｉｉ，，?ｊ｜Ｌｉｉｉ，，??？＿Ｗ?ｔｔ？?１＊５?ｌ－？?２＿５，??Ｄ?￣?．．．．?＇Ｔ＾ＰＴ??■ｎｕ?１１?■?Ｌ?ｉ??＊？？?？－？？?Ｉｊ＊？?ＩＪＳ?ｉＭｆ?ｉ？??Ｋ??，一?丨?Ｆ－＇．ｃｐＶ??ＫＳＨＨＩ??■?Ｈ?■?■?■?１?Ａｊｉ???Ｂ—？，?丨?５�。�?■丨，?｜．？?ＩＭ?？＊??＾?一?■一?，—?？??■Ｈ?□?■■ｎ?：］Ｕｉ??圖２－１：?ＰＣ１２細(xì)胞各部位中細(xì)胞骨架張力的分布情況??Ａ．四種骨架探針：ａｃｔｉｎ?（ＡｃｐＡ）、ｔｕｂｕｌｉｎ?（ＴｃｐＴ）、ｖｉｍｅｎｔｉｎ?（ＶｃｐＶ）、ＧＦＡＰ?（ＧｃｐＧ）??在未分化的ＰＣ１２細(xì)胞中的ＦＲＥＴ和光鏡。Ｂ．?Ａ圖ＦＲＥＴ的效率量化，ｎｓ。Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：??用ＮＧＦ處理ＰＣ１２細(xì)胞３天后，轉(zhuǎn)染含有ａｃｔｉｎ、ｔｕｂｕｌｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＧＦＡＰ探針，檢測ＰＣ１２??細(xì)胞各個部分張力分布情況，用ＣＦＰ／ＦＲＥＴ比值表示。中間的三張小圖分別代表細(xì)胞的胞??體、突起以及突起前端張力的情況。每個實驗重復(fù)５次以上，熒光標(biāo)尺為０．１到２，比例??尺為１０｜ｉｍ。??４．２?ＮＧＦ通過上調(diào)ａｃｔｉｎ和ｖｉｍｅｎｔｉｎ的張力促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長??因為暴露于細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)生長因Ｔ和Ｋ？他信ｙ？分了？與ａｃｔｉｎ細(xì)胞骨架重組密切相??關(guān)［Ｍ，所以本實驗將探討ＮＧＦ對ａｃｔｈｉ骨架產(chǎn)生的解聚影響。如圖２－２Ａ、Ｂ所示，給予高??濃度的ＮＧＦ?（５００ｎｇ／ｍｌ）刺激１５分鐘后，ＰＣ１２細(xì)胞中ａｃｔｉｎ和ｖｉｍｅｎｔｉｎ的張力顯著

Ｓｉｚｅ?（ｎｍ）?Ｓｉｚｅ?（ｎｍ）??Ｄ?＝?：？��？？？?Ｅ?＝＝。??＝＝?ｌ?５００ｌ?＝＝。??＾?１０００－１００００?＞?４００－?１０００－１００００??Ｉ?３００－?｜??Ｉ?Ｉ?３００－??ｌ?２００－?Ｉ?Ｉ?Ｌｏｏ－??１?Ｉ?Ｉ??ｗ?１００－?｜｜?１００－??Ｉ?Ｊ?■－?ｌｌＪ?■■?ｉ?０１?１１１！丄丄??／?／?＾?／?／??ＰＣ１２?ｃｅｌｌｓ?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｃｏｒｔｉｃａｌ?ｎｅｕｒｏｎｓ??圖２－３－１：?ＮＧＦ使細(xì)胞內(nèi)滲透壓、蛋白納米顆粒增力口??Ａ、Ｂ、Ｃ．單獨使用ＮＧＦ、ａｇｇｒｅｃａｎ、聯(lián)合使用ＮＧＦ和ａｇｇｒｅｃａｎ、處理ＰＣ１２細(xì)胞和原代皮層??神經(jīng)元細(xì)胞，１５分鐘后測量細(xì)胞滲透壓、計數(shù)率和粒徑分布圖絕對值。Ｄ．ＰＣ１２細(xì)胞計數(shù)??率的絕對值分布圖。Ｅ．原代皮層神經(jīng)元計數(shù)率絕對值分布圖。每個實驗重復(fù)５次以上，與??對照組相比，＊＊＊ｐ＜０．００１??氯離子在維持細(xì)胞外液離子滲透壓方面發(fā)揮重要作用，而胞內(nèi)氯離子的積累會導(dǎo)致胞??１８??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]黃芪多糖促進(jìn)大鼠周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的實驗研究[D]. 桑秋凌.吉林大學(xué) 2008

碩士論文
[1]甘草苷促進(jìn)PC12神經(jīng)細(xì)胞軸突生長作用[D]. 王俊龍.延邊大學(xué) 2010



本文編號：2945782