本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)及其在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和目的肥胖是由于能量攝入大于消耗導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)過度堆積而形成的一種慢性代謝性疾病。眾所周知,肥胖可以誘發(fā)胰島素抵抗、高血糖、高血壓、高血脂等一系列代謝綜合征,并進一步導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化等心血管疾病甚至癌癥的發(fā)生。近年來,由于飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變,肥胖在全世界的發(fā)病率逐年升高,已經(jīng)發(fā)展為嚴重影響人類健康的疾病。因此針對肥胖的干預(yù)治療是預(yù)防和治療肥胖相關(guān)疾病的重要措施。巨噬細胞是脂肪組織中的重要免疫細胞。目前認為巨噬細胞可分為兩種亞型,一種是經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞,介導(dǎo)炎癥反應(yīng);另一種是選擇性活化的M2型巨噬細胞,具有抑制炎癥的作用。有研究證實,正常的腹內(nèi)白色脂肪組織中以M2巨噬細胞為主,參與維持脂肪組織的免疫穩(wěn)態(tài);而隨著肥胖的發(fā)生,白色脂肪組織中浸潤的巨噬細胞則以M1巨噬細胞為主,介導(dǎo)脂肪組織炎癥的發(fā)生發(fā)展。由于脂肪組織炎癥是胰島素抵抗和代謝綜合征發(fā)生的關(guān)鍵因素,因此調(diào)控巨噬細胞的活化是抑制脂肪組織炎癥、控制肥胖相關(guān)代謝紊亂的重要措施。脂肪來源間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cell,ADSC),是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC),具有多向分化潛能,是目前組織修復(fù)和再生領(lǐng)域的研究重點和熱點。我們的前期工作中證實,ADSC可促進巨噬細胞向M2方向極化,進而抑制肥胖誘發(fā)的脂肪組織炎癥,增強肥胖小鼠對胰島素的敏感性。但ADSC影響巨噬細胞向M2型極化的機制尚不清楚。外泌體(exosome)是由細胞分泌的直徑約在30-150nm大小的囊泡樣結(jié)構(gòu)小體,內(nèi)含有多種具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)和RNA,參與細胞之間信息的交流與傳遞。因來源的細胞不同,外泌體的成分和功能也有所不同。有研究證實,外泌體不但可以作為腫瘤等疾病的生物學(xué)診斷標志物,在疾病的治療中也起到重要作用。MSC因在維持機體穩(wěn)態(tài)中起重要作用,故針對MSC來源外泌體的研究也得到了大家的廣泛關(guān)注。但針對ADSC來源外泌體的研究少有涉及,而ADSC來源外泌體對巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)以及在飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用尚無研究。為了明確ADSC來源外泌體在調(diào)節(jié)巨噬細胞以及飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用,我們進行了以下實驗研究,通過高脂飲食喂養(yǎng)建立小鼠肥胖模型,并用ADSC來源外泌體對肥胖模型小鼠進行干預(yù),證實了 ADSC來源外泌體可以抑制高脂飲食小鼠的脂肪組織炎癥和代謝紊亂,并減緩其肥胖的進展;此外,我們的研究亦證實ADSC來源外泌體可以促進巨噬細胞向M2方向極化,進而抑制肥胖相關(guān)脂肪組織炎癥并延緩肥胖的進展。這為肥胖的干預(yù)治療提供了新的思路與方向。方法一、ADSC的分離擴增和培養(yǎng)取10-12周齡的C57BL/6雄性小鼠的附睪處脂肪組織,將組織剪碎后加入Ⅰ型膠原酶,37℃搖床中消化45分鐘。過濾離心后,把得到的血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction,SVF)接種到六孔板中進行培養(yǎng)擴增,24小時后換液以去除懸浮細胞。當(dāng)細胞達到80%融合度時,可進行細胞傳代。傳代后梭形的貼壁細胞即為ADSC。取第四代細胞進行后續(xù)實驗。二、小鼠腹腔巨噬細胞的獲取取6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠,腹腔注射1ml 6%無菌淀粉溶液,72小時后麻醉后處死小鼠,用無血清的DMEM培養(yǎng)基灌洗腹腔,收集腹腔灌洗液,過濾離心后,用含有10%血清的培養(yǎng)基重懸巨噬細胞,計數(shù),接種于12孔板或者6孔板中,過夜培養(yǎng)后可用于后續(xù)實驗。三、ADSC來源外泌體的提取與鑒定用去除外泌體的培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSC,取第四代ADSC的培養(yǎng)上清,過濾離心后,取上室濃縮液于新的無菌的15ml離心管中,加入Exoquick-TCTM外泌體提取試劑提取外泌體,無菌PBS重懸沉淀并分裝,-80℃冷凍保存。將提取的外泌體分別用納米粒度分析儀、透射電鏡的方法對其大小以及形態(tài)進行檢測,用Western-blot的方法檢測外泌體標志TSG101、CD9、CD63、HSP90的表達。四、體外研究ADSC來源外泌體對巨噬細胞的影響ADSC來源外泌體與小鼠腹腔巨噬細胞共孵育,用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細胞M1相關(guān)表型誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素 12(interleukin-12,IL-12),以及 M2 相關(guān)表型精氨酸酶 1(arginase-1,Arg-1)、白介素 10(interleukin-10,IL-10)的 mRNA 表達水平。Western-blot 檢測 Arg-1的表達變化。用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激經(jīng)外泌體孵育過的巨噬細胞,用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細胞中iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達水平。用ELISA的方法檢測巨噬細胞中炎性因子TNF-α、IL-12的蛋白表達水平。五、小鼠肥胖模型的建立及ADSC來源外泌體干預(yù)治療C57BL/6雄性小鼠在8周齡時給予60%高脂飼料喂養(yǎng)20-26周,以建立飲食誘導(dǎo)肥胖模型,對照組小鼠采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。在高脂飲食喂養(yǎng)末期,對小鼠進行為期6-8周的外泌體干預(yù)治療(腹腔注射,30μg/小鼠,每3天注射一次)。六、ADSC來源外泌體干預(yù)對小鼠肥胖的影響在高脂飲食喂養(yǎng)期間,每周對各組實驗小鼠進行稱重,并于外泌體干預(yù)期間監(jiān)測小鼠攝食量的變化。外泌體干預(yù)結(jié)束后,稱量各組小鼠的體重,觀察外泌體干預(yù)治療對肥胖小鼠體重的影響。麻醉后處死小鼠,取其附睪處白色脂肪組織、皮下白色脂肪組織以及棕色脂肪組織進行稱重,計算各部位脂肪組織重量占體重的百分比,并進行統(tǒng)計分析。七、ADSC來源外泌體干預(yù)對小鼠代謝參數(shù)的影響ADSC來源外泌體治療過程中或治療后,分別對實驗小鼠進行葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test,GTT)、胰島素耐量實驗(insulin glucose tolerance test,ITT)檢測,以及檢測血清中甘油三酯(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的變化。八、ADSC來源外泌體干預(yù)對小鼠白色脂肪組織米色化的影響外泌體干預(yù)結(jié)束后,取小鼠附睪處以及皮下脂肪組織,Trizol法抽提RNA后,用熒光定量PCR的方法檢測棕色脂肪UCP1、PGC1α,米色脂肪標志TBX1、TMEM26的mRNA 水平的表達。Western-blot的方法檢測UCP1在蛋白水平的表達。九、ADSC來源外泌體干預(yù)對脂肪組織炎癥及巨噬細胞活化的影響取小鼠附睪處白色脂肪組織,ELISA檢測附睪處脂肪組織塊培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-10的表達;熒光定量PCR檢測小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-6、IL-12等的表達;流式細胞術(shù)檢測小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中F4/80、Arg-1的表達。結(jié)果一、ADSC來源外泌體促進巨噬細胞向M2型極化將ADSC來源外泌體作用于小鼠腹腔巨噬細胞,熒光定量PCR結(jié)果顯示,外泌體刺激顯著上調(diào)巨噬細胞M2相關(guān)表型Arg-1、IL-10的mRNA表達水平,而其M1相關(guān)表型iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表達水平則無明顯變化。Western-blot結(jié)果顯示,外泌體孵育后巨噬細胞中Arg-1的蛋白表達水平明顯升高。此外,將經(jīng)外泌體孵育的巨噬細胞用LPS和IFN-y進行聯(lián)合刺激,發(fā)現(xiàn)外泌體孵育的巨噬細胞對LPS和IFN-γ刺激的反應(yīng)性明顯降低,其iNOS、TNF-α和IL-12的表達水平較未經(jīng)外泌體孵育的巨噬細胞有顯著下調(diào)。以上結(jié)果提示ADSC來源外泌體可促進巨噬細胞的M2極化,進而抵抗LPS和IFN-y誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)。二、ADSC來源外泌體抑制肥胖小鼠的體重增加將高脂喂養(yǎng)的肥胖模型小鼠分為外泌體干預(yù)組(HFD-exosome)和生理鹽水組(HFD-NS),以常規(guī)飲食喂養(yǎng)的小鼠注射生理鹽水作為對照組(NCD-NS)。外泌體干預(yù)結(jié)束后,對小鼠體重及其小鼠附睪處白色脂肪組織、皮下白色脂肪組織、棕色脂肪組織稱重發(fā)現(xiàn),高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠體重及白色脂肪組織重量明顯增加,而外泌體干預(yù)治療后,小鼠的體重以及各個部位的白色脂肪組織重量較HFD-NS組均明顯下降。三、ADSC來源外泌體改善高脂喂養(yǎng)小鼠的代謝紊亂GTT和ITT結(jié)果顯示,相對于HFD-NS組的小鼠,HFD-exosome組小鼠對葡萄糖的耐受性和對胰島素的敏感性都有明顯的改善,且在多個時間點上均具有統(tǒng)計學(xué)差異。試劑盒檢測血清中甘油三酯和膽固醇的水平發(fā)現(xiàn),高脂飲食喂養(yǎng)后,肥胖小鼠血清中甘油三酯和膽固醇的水平明顯上調(diào),而外泌體干預(yù)治療后血清甘油三酯和膽固醇的水平則明顯下調(diào)。四、ADSC來源外泌體促進高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化外泌體干預(yù)結(jié)束后,取小鼠附睪處以及皮下白色脂肪組織進行熒光定量PCR。結(jié)果顯示,HFD-exosome組中附睪處和皮下白色脂肪組織中棕色及米色脂肪細胞標志基因UCP1、PGC1α、TBX1、TMEM26的表達量較HFD-NS組均有不同程度的升高。Western-blot結(jié)果顯示,與HFD-NS組相比,HFD-exosome組小鼠的附睪處以及皮下白色脂肪組織中UCP1的蛋白水平明顯升高。由此可以看出,ADSC來源外泌體可以促進高脂喂養(yǎng)小鼠的白色脂肪米色化。五、ADSC來源外泌體促進白色脂肪組織中巨噬細胞的M2極化并抑制白色脂肪組織炎癥附睪處白色脂肪組織的體外培養(yǎng)結(jié)果顯示,外泌體干預(yù)治療后,小鼠附睪處白色脂肪組織分泌的促炎細胞因子TNF-α較HFD-NS組明顯降低,而抑炎細胞因子IL-10的表達水平則明顯升高。同時,熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠附睪處白色脂肪組織SVF中TNF-α、IL-12和IL-6的mRNA水平較NCD-NS組均有不同程度的升高,而外泌體干預(yù)則可顯著降低以上炎性細胞因子的表達。相反,外泌體干預(yù)治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠SVF中M2相關(guān)Arg-1的mRNA水平。流式結(jié)果亦顯示,外泌體干預(yù)治療可明顯上調(diào)高脂喂養(yǎng)小鼠白色脂肪組織中巨噬細胞的Arg-1表達水平。以上結(jié)果表明,外泌體干預(yù)可促進脂肪組織中巨噬細胞向抗炎M2巨噬細胞極化,并抑制白色脂肪組織炎癥。結(jié)論一、ADSC來源外泌體可促進巨噬細胞向M2型的極化。二、ADSC來源外泌體干預(yù)治療可抵抗飲食誘導(dǎo)肥胖的進展。三、ADSC來源外泌體可以改善飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的代謝紊亂。四、ADSC來源外泌體干預(yù)治療可抑制肥胖誘發(fā)的脂肪組織炎癥。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

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本文編號：1330397