本文關(guān)鍵詞：基于膠質(zhì)細胞HIF-1α通路調(diào)控細胞凋亡研究清腦滴丸對急性腦缺血再灌注損傷的作用機制　出處：《北京中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：2010年全球疾病負擔報告(Global Burden of Disease,GBD)顯示,卒中位居死因順位第二位,2004-2005年我國全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告顯示,腦血管病升為第一位死因,2010年疾病負擔報告顯示腦血管病死因仍居第一位。其中,缺血性卒中年齡標化發(fā)病率要遠高于出血性卒中。深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制和治療,具有重要的醫(yī)學價值。膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一大類細胞,約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)的90%,除了具有支撐,提供營養(yǎng)及協(xié)助代謝等輔助作用,同時具有興奮性,參與神經(jīng)元的通訊并促進突觸形成和神經(jīng)再生等功能。在急性腦缺血發(fā)生時,星形膠質(zhì)細胞最先受到損傷,受損的膠質(zhì)細胞會殺死鄰近的神經(jīng)元,并且受損的星形膠質(zhì)細胞會發(fā)生凋亡,之后導致神經(jīng)元的二次損傷,最終使腦梗死面積擴大。在缺氧條件下,缺氧誘導因子-1((hypoxia inducible factor-1,HIF-1)可直接或間接調(diào)控100多種下游靶基因的轉(zhuǎn)錄而成為低氧應(yīng)答時穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)中心。HIF-1由穩(wěn)定表達的HIF-1β亞基和受低氧調(diào)控的HIF-1α亞基組成。缺氧狀態(tài)下,HIF-1α廣泛表達于腦組織,包括神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞等,其對腦缺血具有雙重作用。當輕度缺血缺氧時,HIF-1α可激活其下游基因,通過增加血管生成、調(diào)節(jié)糖酵解等方式減少細胞凋亡。嚴重缺血缺氧狀態(tài)下,HIF-1α可通過與p53結(jié)合誘導細胞凋亡,或誘導bcl2(B-cell lymphoma 2)家族中的凋亡前基因BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein3)表達等途徑誘導細胞凋亡。缺氧條件下HIF-1與BNIP3基因啟動子的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-response element,HRE)序列結(jié)合,從而促進BNIP3表達,而BNIP3能通過促進H+內(nèi)流或細胞色素C的釋放等方式來促進凋亡。清腦滴丸(又名清腦宣竅滴丸)是經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)的方劑,治療缺血性腦中風急性期和恢復早期均有很好的療效。此方由梔子、三七和冰片三味藥物組成,三藥共奏清熱瀉火、活血宣竅之功效,臨床研究報道,清腦滴丸對改善中醫(yī)證候方面尤其是對"善忘遲鈍、頭痛、眩暈、口苦咽干、大便秘結(jié)、舌苔黃"火熱、血瘀癥狀有明顯改善作用,可改善患者神經(jīng)功能缺損程度。實驗研究發(fā)現(xiàn)清腦滴丸可通過減輕酸中毒,抑制自由基產(chǎn)生和粘附分子表達等來調(diào)控腦缺血再灌注損傷的代謝紊亂,抑制JNK磷酸化蛋白過表達來降低細胞凋亡,減輕腦損傷。[研究目的]從HIF-lα調(diào)控細胞凋亡探討清腦滴丸對大鼠腦缺血再灌注損傷和C6膠質(zhì)細胞氧糖剝奪損傷中的作用,闡釋清腦滴丸保護腦缺血再灌注損傷的分子機制。[研究方法]1、體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)細胞,采用氧糖剝奪/復氧的方法建立細胞損傷模型。細胞氧糖剝奪24h后,分別復氧復糖Oh、3h、6h,同時給予不同濃度的清腦滴丸(0.625 g/L、QNDW 1.25g/L),CCK8法測定細胞活力,篩選最佳時效點和最佳量效。Western Blot法觀察各組HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表達情況,免疫熒光染色法觀察各組HIF-1α、Caspase-3的表達情況。2、線栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型,Garcia GH法和TTC染色檢測大鼠神經(jīng)功能缺損程度及腦梗死體積,Western Blot法檢測缺血側(cè)皮層HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表達情況,熒光染色法檢測HIF-1α、GFAP的表達情況。[研究結(jié)果]1、細胞實驗①與相應(yīng)的正常組相比,氧糖剝奪24h復氧3h、6h組細胞活力(P0.01);其中氧糖剝奪24h/復氧6h細胞活力最低,且損傷細胞約50%,因此確定時間點為氧糖剝奪24h/復氧6h。②與氧糖剝奪24h/復氧6h模型組相比,清腦滴丸0.625 g/L濃度組、清腦滴丸1.25g/L濃度組細胞活力均明顯上升(P0.05),其中,清腦滴丸1.25g/L濃度組細胞活力最高。③Western Blot法檢測結(jié)果:與正常組相比,氧糖剝奪24h/復氧6h組細胞HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3蛋白表達都增加(P0.05);與氧糖剝奪24h/復氧6h組相比,清腦滴丸1.25g/L濃度組細胞HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白表達都降低(P0.05)。④免疫熒光染色檢測結(jié)果:與正常組相比,氧糖剝奪24h/復氧6h組HIF-1α、Caspase-3表達顯著增加(P0.05);與氧糖剝奪24h/復氧6h組相比,清腦滴丸1.25g/L濃度組HIF-1α、Caspase-3 表達顯著降低(p0.05)。2、動物實驗①與假手術(shù)組相比,腦缺血1.5h再灌注24h組腦梗死面積增加(P0.05),神經(jīng)功能缺損評分降低(P0.01);與腦缺血1.5h再灌注24h組相比,清腦滴丸組和HIF-1α抑制劑組腦梗死面積都降低(P0.05),神經(jīng)功能缺損評分都增加(P0.01)。②Western Blot法檢測結(jié)果:與假手術(shù)組相比,腦缺血1.5h再灌注24h組中HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3蛋白表達都增加(P0.05);與腦缺血1.5h再灌注24h組相比,清腦滴丸組和HIF-1 α抑制劑組中HIF-1 α、BNIP3、Caspase-3表達都降低(P0.05),清腦滴丸組明顯降低HIF-1α、BNIP3、Caspase-3蛋白過表達。③免疫熒光染色檢測結(jié)果:HIF-1α與GFAP可共表達于細胞中,即HIF-1α可表達于星型膠質(zhì)細胞中。與正常組相比,腦缺血1.5h再灌注24h組HIF-1α表達顯著增加(P0.05);與腦缺血1.5h再灌注24h組相比,清腦滴丸組和HIF-1 α抑制劑組HIF-1α表達顯著降低(P0.05)。[結(jié)論]清腦滴丸可通過抑制腦缺血再灌注凋亡而發(fā)揮保護作用,其機制可能與通過下調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠和C6膠質(zhì)細胞的HIF-1α的過表達,降低BNIP3和Caspase-3蛋白表達有關(guān)。本研究的創(chuàng)新點從HIF1a與細胞凋亡角度,在組織、細胞、分子水平闡釋了清腦滴丸對腦缺血再灌注損傷的保護機制,為臨床用藥提供了科學依據(jù)。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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