本文關(guān)鍵詞：擬南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

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【摘要】：植物生長素作為最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素,在植物生長發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前,植物生長素的生物合成、運(yùn)輸、降解及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制方面的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。其中,生長素受體TIR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子Aux/IAAs、特別是這兩者組成的共受體對生長素具有較高的特異親和性,這為TIR1和Aux/IAAs在生長素的分離純化方面的應(yīng)用提供了啟示,為此,獲得大量的活性TIR1和Aux/IAAs蛋白是重要基礎(chǔ)。因此,本文以野生型擬南芥為材料,通過RT-PCR獲得AtIAA7和AtTIRl序列,以帶有GST純化標(biāo)簽的pGEX-KG和pIEx-3載體為基本骨架,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-KG-IAA7、pGEX-KG-TIR1和真核表達(dá)載體pIEx-3-IAA7、pIEx-3-TIR1。將原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta(DE3)、BL21(DE3)、Tuner(DE3),優(yōu)化了重組蛋白的表達(dá)和純化條件。結(jié)果表明：GST-IAA7蛋白在Rosset中表達(dá)較好,最佳誘導(dǎo)條件為25℃下04 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h,在此條件下可收獲1.6%(鮮重)的重組蛋白；GST-TIR1蛋白則在Ross et菌株中、以0.4 mmol/L濃度的IPTG、于25℃誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)最好,但GST-TIR1重組蛋白以包涵體形式存在。然后,利用GST親和樹脂對GST-IAA7進(jìn)行純化,在純化過程中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)可顯著增強(qiáng)GST-IAA7重組蛋白在體外的穩(wěn)定性；最后用凝血酶切除GST標(biāo)簽獲得了單一的IAA7蛋白。此外,在建立和優(yōu)化黑腹果蠅S2胚胎細(xì)胞的培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上,將真核表達(dá)載體pIEx-3-IAA7轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)IAA7的細(xì)胞系,結(jié)果表明：胎牛血清對S2細(xì)胞短期內(nèi)生長的影響并不大；將pIEx-3-IAA7與篩選質(zhì)粒pCoHygro共轉(zhuǎn)染S2果蠅胚胎細(xì)胞,經(jīng)潮霉素B篩選,獲得能夠表達(dá)IAA7重組蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系；并用GST親和樹脂從細(xì)胞培養(yǎng)液中成功分離和純化到IAA7重組蛋白。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 IAA7 TIR1 重組蛋白 原核表達(dá) 真核表達(dá) 果蠅S2細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-20
• 1 國內(nèi)外研究進(jìn)展10-18
• 1.1 植物生長素及其作用10
• 1.2 生長素檢測技術(shù)10-12
• 1.3 生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)12-15
• 1.3.1 生長素信號途徑12-13
• 1.3.2 生長素轉(zhuǎn)錄抑制蛋白Aux/IAA13
• 1.3.3 生長素受體TIR113-15
• 1.4 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)15-18
• 1.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)15-16
• 1.4.2 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)16-17
• 1.4.3 重組蛋白的純化17-18
• 2 研究目的和意義18-19
• 3 本研究的總體思路19-20
• 第二章 IAA7和TIR1的原核表達(dá)及其分離純化20-42
• 1 材料與方法20-28
• 1.1 相關(guān)材料20
• 1.2 IAA7和TIR1的克隆20-23
• 1.2.1 擬南芥RNA提取及反轉(zhuǎn)錄20-21
• 1.2.2 引物設(shè)計(jì)21-22
• 1.2.3 目的基因獲得22-23
• 1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化23-27
• 1.3.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備23-24
• 1.3.2 IAA7和TIR1目的基因的T克隆24-26
• 1.3.3 IAA7和TIR1原核表達(dá)載體的構(gòu)建26-27
• 1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)27
• 1.4.1 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)27
• 1.4.2 重組蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化27
• 1.5 重組蛋白的分離與純化27-28
• 2 結(jié)果與分析28-39
• 2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建28-31
• 2.1.1 獲得高質(zhì)量總RNA28-29
• 2.1.2 獲得目的基因29-31
• 2.1.3 成功構(gòu)建IAA7和TIR1的原核表達(dá)載體31
• 2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化31-36
• 2.2.1 重組蛋白在不同菌株中的表達(dá)31-33
• 2.2.2 誘導(dǎo)溫度對重組蛋白表達(dá)量的影響33-34
• 2.2.3 誘導(dǎo)劑濃度對重組蛋白表達(dá)量的影響34-35
• 2.2.4 重組蛋白的定量35-36
• 2.3 重組蛋白的分離純化36-38
• 2.3.1 重組蛋白的純化36-37
• 2.3.2 IAA7蛋白的分離37-38
• 2.4 重組蛋白的穩(wěn)定性分析38-39
• 3 討論39-42
• 3.1 重組蛋白的原核表達(dá)與純化39-40
• 3.2 影響重組蛋白穩(wěn)定性的因素40-42
• 第三章 IAA7和TIR1重組蛋白在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)42-54
• 1 材料與方法42-47
• 1.1 相關(guān)材料42
• 1.2 果蠅S2胚胎細(xì)胞的培養(yǎng)42-43
• 1.2.1 培養(yǎng)基及主要緩沖液42
• 1.2.2 S2細(xì)胞的復(fù)蘇42
• 1.2.3 S2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)42-43
• 1.2.4 S2細(xì)胞的保存43
• 1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建43-45
• 1.3.1 引物設(shè)計(jì)43-44
• 1.3.2 目的基因獲得44
• 1.3.3 IAA7和TIR1目的基因的T克隆44
• 1.3.4 IAA7和TIR1真核表達(dá)載體的構(gòu)建44-45
• 1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞,篩選穩(wěn)定細(xì)胞株45-46
• 1.4.1 大量提質(zhì)粒45
• 1.4.2 重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞與篩選穩(wěn)定細(xì)胞系45-46
• 1.5 重組蛋白的表達(dá)與純化46-47
• 2 結(jié)果與分析47-52
• 2.1 S2果蠅胚胎細(xì)胞的培養(yǎng)條件優(yōu)化47-48
• 2.1.1 培養(yǎng)方式對細(xì)胞生長的影響47
• 2.1.2 胎牛血清對細(xì)胞生長的影響47-48
• 2.2 重組載體的構(gòu)建及鑒定48-50
• 2.2.1 獲得IAA7和TIR1目的基因48-49
• 2.2.2 成功構(gòu)建IAA7和TIR1的真核表達(dá)載體49-50
• 2.3 獲得穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染的IAA7細(xì)胞株系50-51
• 2.4 重組蛋白的表達(dá)及純化51-52
• 2.4.1 IAA7重組蛋白的表達(dá)與純化51-52
• 3 討論52-54
• 3.1 S2果蠅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)52-53
• 3.2 影響S2胚胎細(xì)胞外源蛋白表達(dá)的因素53-54
• 第四章 全文總結(jié)及后續(xù)研究設(shè)想54-56
• 1 全文總結(jié)54
• 2 特色及創(chuàng)新54-55
• 3 后續(xù)研究設(shè)想55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 致謝63-64
• 作者簡介64

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本文編號：881319