Nanog是一種在內(nèi)細胞團、原始生殖細胞以及ESCs表達的新轉錄因子。屬于ANTP類,NK家族基因。在胚胎發(fā)育及干細胞分化中有著重要作用。本研究針對牛的NANOG基因的一段序列設計特異識別的gRNA并構建了 CRISPR/Cas9表達載體。實驗選用的骨架載體具有新霉素抗性基因(Neor)表達框架和報告基因EGFP,構建了針對CRISPR/Cas9切割位點的同源打靶載體pNlrkt。其外源基因為EGFP,在報告基因的上游包含長801bp的5'同源臂,在(Neor)表達框架下游包含長370bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析和序列測定分析的結果表明,所構建的pNlrkt載體正確。將構建成功的載體pNlrkt用脂質(zhì)體轉染方法導入到人胚胎干細胞MelI細胞系中,經(jīng)24h培養(yǎng)后,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,結果表明pNlrkt載體可指導EGFP使其在人胚胎干細胞中發(fā)光。為了獲得EGFP基因在NANOG基因位點定點整合的細胞系,檢測CRISPR/Cas9介導的外源基因整合效率,通過電轉染的方法將CRISPR/Cas9:pNlrkt導入到秦川牛胎兒成纖維細胞中,經(jīng)過G418篩選、口吸管和流式細胞儀挑單...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２雙酶切電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｏｒｉｇｉｎａｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＰａｃＩ?ａｎｄ?Ｋｐｎｌ??

經(jīng)Ｔ４聚合酶末端平齊化處理，Ｔ４連接酶進行質(zhì)粒自連，轉化、挑取陽性菌落、??小提質(zhì)粒并命名為ｐＧｌｒｋｔ－２，用ＰａｃＩ和Ｋｐｎｌ酶對ｐＧｌｒｋｔ－２進行雙酶切驗證，電??泳結果顯示（圖１＿２），與預期結果相符，表明ＧＡＧ啟動子己被完全切除且自??連成功。??１?２?３?Ｍ??■....

圖１－３?同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??

?同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??Ｍ為ｌｋｂ?Ｐｈｉｓ?ｍａｒｋｅｒ；左圖１－４為３’同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物；右圖１－４為５’同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物??Ｍ：ｌｋｂ?Ｐｌｕｓ?ｍａ....

圖１－５酶切鑒定ｐＮｌｒ載體電泳圖

?１?｜?ｆ＇、．、．，：，：：?ｊ?…Ｊ丨?＜—９１６ｂｐ??．圖１－５酶切鑒定ｐＮｌｒ載體電泳圖?圖１－６酶切鑒定ｐＮｌｒｋｔ載體電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ....

圖１＿７綠色熒光蛋白在在人胚胎干細胞的表達情況??Ｆｉｇｕｒｅ?ｌ－７Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＧＦＰ?ｉｎ?ｈｕｍａｎ?ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ??

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本文編號：4021816