Nanog是一種在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始生殖細(xì)胞以及ESCs表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子。屬于ANTP類,NK家族基因。在胚胎發(fā)育及干細(xì)胞分化中有著重要作用。本研究針對(duì)牛的NANOG基因的一段序列設(shè)計(jì)特異識(shí)別的gRNA并構(gòu)建了 CRISPR/Cas9表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)選用的骨架載體具有新霉素抗性基因(Neor)表達(dá)框架和報(bào)告基因EGFP,構(gòu)建了針對(duì)CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)的同源打靶載體pNlrkt。其外源基因?yàn)镋GFP,在報(bào)告基因的上游包含長(zhǎng)801bp的5'同源臂,在(Neor)表達(dá)框架下游包含長(zhǎng)370bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析和序列測(cè)定分析的結(jié)果表明,所構(gòu)建的pNlrkt載體正確。將構(gòu)建成功的載體pNlrkt用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入到人胚胎干細(xì)胞MelI細(xì)胞系中,經(jīng)24h培養(yǎng)后,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,結(jié)果表明pNlrkt載體可指導(dǎo)EGFP使其在人胚胎干細(xì)胞中發(fā)光。為了獲得EGFP基因在NANOG基因位點(diǎn)定點(diǎn)整合的細(xì)胞系,檢測(cè)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外源基因整合效率,通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法將CRISPR/Cas9:pNlrkt導(dǎo)入到秦川牛胎兒成纖維細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)G418篩選、口吸管和流式細(xì)胞儀挑單...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２雙酶切電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｏｒｉｇｉｎａｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＰａｃＩ?ａｎｄ?Ｋｐｎｌ??

經(jīng)Ｔ４聚合酶末端平齊化處理，Ｔ４連接酶進(jìn)行質(zhì)粒自連，轉(zhuǎn)化、挑取陽(yáng)性菌落、??小提質(zhì)粒并命名為ｐＧｌｒｋｔ－２，用ＰａｃＩ和Ｋｐｎｌ酶對(duì)ｐＧｌｒｋｔ－２進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，電??泳結(jié)果顯示（圖１＿２），與預(yù)期結(jié)果相符，表明ＧＡＧ啟動(dòng)子己被完全切除且自??連成功。??１?２?３?Ｍ??■....

圖１－３?同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??

?同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??Ｍ為ｌｋｂ?Ｐｈｉｓ?ｍａｒｋｅｒ；左圖１－４為３’同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物；右圖１－４為５’同源臂ＰＣＲ產(chǎn)物??Ｍ：ｌｋｂ?Ｐｌｕｓ?ｍａ....

圖１－５酶切鑒定ｐＮｌｒ載體電泳圖

?１?｜?ｆ＇、．、．，：，：：?ｊ?…Ｊ丨?＜—９１６ｂｐ??．圖１－５酶切鑒定ｐＮｌｒ載體電泳圖?圖１－６酶切鑒定ｐＮｌｒｋｔ載體電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ....

圖１＿７綠色熒光蛋白在在人胚胎干細(xì)胞的表達(dá)情況??Ｆｉｇｕｒｅ?ｌ－７Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＧＦＰ?ｉｎ?ｈｕｍａｎ?ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ??

：?１?｜?ｆ＇、．、．，：，：：?ｊ?…Ｊ丨?＜—９１６ｂｐ??．圖１－５酶切鑒定ｐＮｌｒ載體電泳圖?圖１－６酶切鑒定ｐＮｌｒｋｔ載體電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔ....

本文編號(hào)：4021816