發(fā)布時間：2022-01-17 09:05

　　DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和糖基化酶是生命體中重要的兩種酶。這兩種酶的異常表達(dá)均會引起DNA堿基變化,甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此,開發(fā)簡單、有效的檢測甲基轉(zhuǎn)移酶和糖基化酶活性的方法對疾病的診斷和療效監(jiān)測具有重要意義。本文基于實時連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time LCR）分別建立了一種檢測甲基轉(zhuǎn)移酶和糖基化酶的新方法。具體內(nèi)容如下:一、基于實時連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶。我們設(shè)計了兩條完全互補且中間含5’-CCGG-3’序列的長DNA鏈T1、T2。當(dāng)存在M.SssI時,甲基化的長DNA鏈不會被HpaII識別并切割,它會作為LCR的模板引發(fā)LCR反應(yīng),熒光染料SYBR Green I嵌入LCR產(chǎn)物中熒光增強。反之無M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶時,無法引發(fā)體系中的LCR反應(yīng)。通過檢測熒光強度的變化可實現(xiàn)該方法對M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測,線性范圍為0.002 U/mL-0.1 U/mL,檢出限為0.001 U/mL。該方法還可用于M.SssI抑制劑的篩選,并且適用于復(fù)雜的生物樣品。我們建立的M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶檢測方法設(shè)計簡單、操作簡便、成本低,對于臨床診斷和藥物開發(fā)具有重要意義。二、... 

【文章來源】：河北大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

基于熱敏聚合物（N-異丙基丙烯酰胺）高靈敏熒光檢測甲基轉(zhuǎn)移酶原理[34]

河北大學(xué)碩士學(xué)位論文10雜交，形成帶有缺口的DNA雜交體。在UDG的作用下，發(fā)夾環(huán)中的兩個尿嘧啶堿基被去除，以生成兩個AP位點。位于缺口3"側(cè)的AP位點抑制了連接酶的連接，使發(fā)夾探針末端的兩段序列仍然相鄰。進(jìn)一步打開H1，再打開H2，H2打開后暴露G4結(jié)構(gòu)，CHA反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生大量G4結(jié)構(gòu)，可嵌入N-甲基-間卟啉IX（NMM）產(chǎn)生強的熒光信號。在UDG不存在時，連接酶將與發(fā)卡式探針互補的短核苷酸連接，不再與H1雜交，從而禁止CHA反應(yīng)，不會有熒光信號。該方法在0.0005-0.02U/mL范圍內(nèi)實現(xiàn)了對UDG活性的檢測，但是該方法的線性范圍較窄。圖1-6尿嘧啶去除抑制連接與催化發(fā)夾組裝用于檢測尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[48]。1.3.2切口酶依賴的鏈置換擴增切口酶依賴的鏈置換擴增（Stranddisplacementamplification，SDA）是通過限制性內(nèi)切酶在dsDNA中一條鏈上形成缺口，無5"-3"核酸外切酶活性的DNA聚合酶從缺口處3"端進(jìn)行延伸反應(yīng)，同時將下游的舊鏈解離。限制性內(nèi)切酶繼續(xù)作用，新的缺口再次產(chǎn)生并進(jìn)入下一輪循環(huán)。最后產(chǎn)生多條被置換出來的單鏈DNA（ssDNA）。Wang等人提出了基于切除修復(fù)引發(fā)的酶輔助雙級聯(lián)信號放大策略檢測尿嘧啶DNA糖基化酶活性的方法[49]。原理如圖1-7所示，該實驗涉及（1）UDG尿嘧啶切除修復(fù)，（2）切除修復(fù)引發(fā)的切口酶介導(dǎo)的鏈置換擴增，（3）核糖核酸酶H（RNaseH）誘導(dǎo)的信號探針?biāo)猱a(chǎn)生熒光信號。在UDG的存在時，莖環(huán)DNA底物去除尿嘧啶產(chǎn)生一個AP位點。核酸內(nèi)切酶IV（EndoIV）隨后切割A(yù)P位點，切斷DNA底物啟動鏈置換擴增，產(chǎn)生大量的短鏈DNA（圖中Trigger）。Trigger與另一模板雜交，再次發(fā)生切口酶介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，進(jìn)一步生成更多Trigger。Trigger可與經(jīng)FAM和BHQ1修飾的RNA信

第1章引言11號探針雜交，形成RNA-DNA雙鏈體。RNaseH隨后水解RNA-DNA雙鏈體中的RNA釋放Trigger，Trigger再次雜交水解信號探針，信號探針的不斷水解，使熒光信號恢復(fù)，可實現(xiàn)對UDG的檢測。但該方法需要聚合酶、限制性內(nèi)切酶、RNaseH、FAM和BHQ1修飾的RNA信號探針，成本較高。圖1-7基于切除修復(fù)引發(fā)的酶輔助雙級聯(lián)信號放大策略檢測尿嘧啶DNA糖基化酶活性的原理[49]。1.3.3滾環(huán)擴增滾環(huán)擴增（RollingCircleAmplification，RCA）是一種恒溫核酸擴增方法，以環(huán)狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物（與環(huán)狀模板互補），在酶催化作用下將dNTPs聚合為ssDNA，此ssDNA包含多個重復(fù)的模板互補片段。圖1-8基于EndoIV輔助的滾環(huán)擴增熒光分析法檢測尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[50]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA損傷修復(fù)與癌癥[J]. 回天鶴.  臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志. 2017(79)



本文編號：3594455