第一部分斑馬魚（Danio rerio）為原產(chǎn)喜馬拉雅山脈東南區(qū)域（包括印度、巴基斯坦、柬埔寨等國(guó)家和地區(qū)）的一種觀賞用熱帶淡水魚,其作為一種脊椎模式生物被應(yīng)用于科學(xué)研究肇始于1970年代。經(jīng)過(guò)30余年從無(wú)到有、由淺及深的認(rèn)識(shí)過(guò)程,這種體積小、繁殖快、易于飼養(yǎng)的硬骨魚類正以其巨大的優(yōu)勢(shì)愈來(lái)愈被人們所重視。隨著斑馬魚基因組測(cè)序的全面完成,人們發(fā)現(xiàn)至少70%的人類基因在斑馬魚中都存在至少一個(gè)同源基因,這使得斑馬魚成為了功能基因組時(shí)代最重要的模式生物之一。要研究基因的功能,一個(gè)重要的、甚至是首選的做法就是,敲除或者突變?cè)摶?進(jìn)而研究該基因功能缺失條件下的表現(xiàn)型。定點(diǎn)敲除基因的技術(shù)在近幾年發(fā)展迅速,ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等基因敲除系統(tǒng)不斷涌現(xiàn),相比于前兩者操作繁瑣、突變效率低的缺點(diǎn),CRISPR/Cas9技術(shù)以其簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)成為最近最為流行的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。本研究即是使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對(duì)數(shù)個(gè)斑馬魚基因做定點(diǎn)敲除并探究其工作條件、工作效率及基因敲除突變體的表現(xiàn)型。首先,作者使用已報(bào)道的方法合成人密碼子優(yōu)化的Cas9mRNA和基因特異的gRNA,用不同... 

【文章來(lái)源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：106 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 遺傳研究的方法和基因敲除
        1.1.1 遺傳研究方法總述
        1.1.2 現(xiàn)代基因敲除技術(shù)的先軍——ZFNs
        1.1.3 現(xiàn)代基因敲除技術(shù)的典范——TALENs
        1.1.4 現(xiàn)代基因敲除技術(shù)的新寵——RISPR/Cas9
    1.2 斑馬魚簡(jiǎn)介及其研究現(xiàn)狀
        1.2.1 斑馬魚簡(jiǎn)介
        1.2.2 斑馬魚的研究現(xiàn)狀
    1.3 斑馬魚的造血作用
        1.3.1 斑馬魚的造血作用之總述
        1.3.2 由實(shí)時(shí)成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)斑馬魚中HSC的產(chǎn)生過(guò)程
第二章 緒論
    2.1 本研究工作的目的和意義
        2.1.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚中進(jìn)行基因敲除
        2.1.2 利用轉(zhuǎn)基因系Tg(corola：Kaede)追蹤造血干細(xì)胞的分化及遷移
        2.1.3 制作血液系統(tǒng)相關(guān)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以期結(jié)合轉(zhuǎn)基因系進(jìn)一步探討HSPCs的分化去路
    2.2 本研究工作的研究?jī)?nèi)容和預(yù)期結(jié)果
        2.2.1 本研究工作的研究?jī)?nèi)容
        2.2.2 本研究工作的預(yù)期結(jié)果
第三章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    3.1 斑馬魚品系、飼養(yǎng)及其生活史
        3.1.1 斑馬魚簡(jiǎn)介及品系
        3.1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑以及耗材
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)耗材
    3.3 試劑配制
        3.3.1 分子克隆相關(guān)
        3.3.2 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)
        3.3.3 其他試劑
    3.4 菌株和質(zhì)粒
    3.5 利用MgCl_2法制備E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞
    3.6 利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作斑馬魚突變體
        3.6.1 針對(duì)基因設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作目標(biāo)位點(diǎn)
        3.6.2 利用pXT7-hCas9制作hCas9 mRNA
        3.6.3 利用pMD19T-gRNA和PCR制作基因特異的gRNA
        3.6.4 顯微注射
        3.6.5 通過(guò)測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)瞬時(shí)工作效率
        3.6.6 通過(guò)T-A末端連接進(jìn)一步檢測(cè)工作效率
        3.6.7 通過(guò)測(cè)序從F0代中篩選可遺傳突變的個(gè)體
        3.6.8 通過(guò)測(cè)序從F1代中篩選穩(wěn)定遺傳的突變個(gè)體
        3.6.9 通過(guò)雜合子自交探究某基因突變體的表型
    3.7 使用Tg(corola：Kaede)短時(shí)追蹤HSPCs的分裂與分化
    3.8 使用tol2系統(tǒng)制作轉(zhuǎn)基因斑馬魚
        3.8.1 轉(zhuǎn)座酶mRNA的制備
        3.8.2 顯微注射
        3.8.3 對(duì)轉(zhuǎn)基因家系F0代的驗(yàn)證
        3.8.4 對(duì)轉(zhuǎn)基因家系F1代的驗(yàn)證
第四章 研究結(jié)果與分析
    4.1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除的嘗試及規(guī)律總結(jié)
        4.1.1 hCas9 mRNA和gRNA注射劑量的嘗試
        4.1.2 針對(duì)1號(hào)染色體上4個(gè)基因的敲除實(shí)驗(yàn)
        4.1.3 對(duì)成功和失敗的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)案例進(jìn)行分別的規(guī)律總結(jié)
        4.1.4 應(yīng)用規(guī)律在3個(gè)感興趣基因(GOD中設(shè)計(jì)靶點(diǎn)的敲除效果
    4.2 使用轉(zhuǎn)基因系Tg(corola：Kaede)追蹤HSPCs的結(jié)果
        4.2.1 corola-Kaede可標(biāo)記HSPCs
        4.2.2 Kaede蛋白可在高能激光輻照下改變構(gòu)象
        4.2.3 使用光可變熒光蛋白Kaede對(duì)CHT產(chǎn)生的HSPCs進(jìn)行跟蹤成像結(jié)果
        4.2.4 對(duì)更多AGM/CHT產(chǎn)生HSPCs的追蹤結(jié)果
    4.3 制作轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)
第五章 結(jié)論與建議
    5.1 CRISPR/Cas9工作效率可變性的探討
    5.2 CHT發(fā)生的HSPCs和AGM區(qū)相比的聯(lián)系和差異
    5.3 轉(zhuǎn)基因品系Tg(corola：LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP)的制作
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
在讀期間發(fā)表論文及參與課題
    發(fā)表論文
    參與其他課題


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Efficient Gene Targeting in Zebrafish Mediated by a Zebrafish-Codon-Optimized Cas9 and Evaluation of Off-Targeting Effect[J]. Da Liu,Zhanxiang Wang,An Xiao,Yutian Zhang,Wenyuan Li,Yao Zu,Shaohua Yao,Shuo Lin,Bo Zhang.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
[2]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao.  Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[3]斑馬魚研究走向生物醫(yī)學(xué)[J]. 李輝輝,黃萍,董巍,朱作言,劉東.  遺傳. 2013(04)
[4]A Systematic Phenotypic Screen of F-box Genes Through a Tissue-specific RNAi-based Approach in Drosophila[J]. Wen Dui~(a,b,c),Wei Lu~a,Jun Ma~(c,d,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Division of Biomedical Informatics,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA d Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Research Foundation,3333 Burnet Avenue,Cincinnati,OH 45229,USA.  遺傳學(xué)報(bào). 2012(08)
[5]Drosophila sbo regulates lifespan through its function in the synthesis of coenzyme Q in vivo[J]. Jiyong Liu~(a,b),Qinghua Wu~(a,b),Dianlu He~a,Tengyu Ma~a,Li Du~a,Wen Dui~(a,b), Xiaoyan Guo~(a,c),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China b Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100080,China c Department of Biology,Texas A&M University,College Station,TX 77843,USA.  遺傳學(xué)報(bào). 2011(06)



本文編號(hào)：3557004