本論文分為兩個(gè)部分。本文第一部分工作,載脂蛋白B m RNA編輯酶,催化多肽-1,即APOBEC1（Apolipoprotein B m RNA editing enzyme,catalytic polypeptide 1,簡(jiǎn)稱A1）是APOBEC家族成員,在輔助因子A1CF（APOBEC1 complemetation factor）和/或RNA結(jié)合模體蛋白R(shí)BM47（RNA binding motif protein 47）的存在下特異性結(jié)合載脂蛋白B m RNA（Apolipoprotein B m RNA,Apo B m RNA）并催化脫氨基化第6666位胞嘧啶（C6666）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║6666）,產(chǎn)生載脂蛋白B截短體Apo B48,從而參與調(diào)控與脂質(zhì)代謝相關(guān)的生理過程,但具體機(jī)理不清楚。此外,A1還調(diào)控多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)進(jìn)而參與腫瘤病變,或編輯病毒基因組從而抑制部分逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制。為了后期結(jié)構(gòu)解析及藥物篩選需要,側(cè)重APOBEC1、A1CF及RBM47樣品制備與結(jié)晶條件初篩。為此我們嘗試了多種表達(dá)質(zhì)粒及優(yōu)化蛋白純化方法后,發(fā)現(xiàn)常規(guī)的表達(dá)體系中A1通常以包涵體形式表... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 研究背景及意義
        1.1.1 AID
        1.1.2 APOBEC2
        1.1.3 APOBEC3
        1.1.4 APOBEC4
        1.1.5 APOBEC1
        1.1.6 A1 輔助蛋白A1CF及 RBM
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.2.1 APOBEC1 結(jié)構(gòu)研究
        1.2.2 APOBEC1 催化ApoB mRNA胞嘧啶脫氨機(jī)制研究
        1.2.3 APOBEC1 其他功能研究
        1.2.4 輔助蛋白功能研究
    1.3 論文立意
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 主要試劑與耗材
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)材料配制
        2.3.1 蛋白表達(dá)純化相關(guān)溶液
        2.3.2 蛋白純化緩沖溶液
        2.3.3 凝膠電泳相關(guān)溶液
        2.3.4 超級(jí)感受態(tài)的制備
    2.4 質(zhì)粒構(gòu)建的材料與方法
        2.4.1 引物信息
        2.4.2 實(shí)驗(yàn)方法
第3章 A1的表達(dá)純化
    3.1 A1 表達(dá)方法探索
        3.1.1 A1 表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
        3.1.2 三種載體的小量表達(dá)
        3.1.3 應(yīng)對(duì)A1 包涵體表達(dá)的4 種策略
    3.2 A1-pMAL表達(dá)載體的設(shè)計(jì)
    3.3 蛋白表達(dá)
        3.3.1 蛋白小量表達(dá)測(cè)試
        3.3.2 蛋白大量表達(dá)
    3.4 蛋白提取與純化
        3.4.1 裂解細(xì)菌
        3.4.2 蛋白純化與鑒定
    3.5 本章小結(jié)
第4章 輔助蛋白的表達(dá)純化
    4.1 輔助蛋白的表達(dá)
        4.1.1 質(zhì)粒設(shè)計(jì)與構(gòu)建
        4.1.2 輔助蛋白小量表達(dá)
    4.2 輔助蛋白純化
        4.2.1 A1CF純化方法
        4.2.2 RBM47 純化方法
    4.3 本章小結(jié)
第5章 輔助蛋白晶體篩選
    5.1 核酸制備
        5.1.1 核酸序列
        5.1.2 ApoB mRNA制備
    5.2 RBM47 熒光偏振實(shí)驗(yàn)
        5.2.1 樣品準(zhǔn)備
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    5.3 晶體篩選
        5.3.1 結(jié)晶試劑與方法
        5.3.2 晶體篩選進(jìn)展
    5.4 本章小結(jié)
第6章 氧化酶PrhA的改造
    6.1 課題背景與立意
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.1 基本材料
        6.2.2 蛋白純化緩沖液
    6.3 pET28a-PrhA-A232Y表達(dá)純化
        6.3.1 pET28a-PrhA-A232Y載體構(gòu)建與表達(dá)
        6.3.2 His-PrhA-A232Y純化方法
    6.4 PrhA-A232Y活性測(cè)試
    6.5 本章小結(jié)
第7章 總結(jié)與討論
    7.1 胞嘧啶脫氨基酶A1 及其輔助蛋白的制備與晶體初篩
    7.2 氧化酶PrhA的改造
參考文獻(xiàn)
附錄 縮略語
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]胞嘧啶脫氨基化酶APOBEC3家族及其與核酸復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J]. 金交羽,嚴(yán)小璇,劉亞平,藍(lán)文賢,王春喜,許斌,曹春陽.  化學(xué)學(xué)報(bào). 2019(11)
[2]APOBEC3F蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 歐陽昌鑫,盧秀秀,趙玢,藍(lán)文賢,朱愛萍.  生命的化學(xué). 2014(06)



本文編號(hào)：3151423